畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文）-重樓葉多糖提取工藝及其抗氧化活性研究

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1、巴黎重樓葉多糖提取工藝及其抗氧化活性研究[摘要]在單因素分析的基礎(chǔ)上，利用中心組合設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化巴黎重樓葉多糖的提取條件。設(shè)置三個(gè)獨(dú)立的變量，包括提取溫度（℃），水料比和時(shí)間（h)并研究其對(duì)多糖得率的影響。采用多元回歸分析和統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對(duì)擬合一個(gè)二次多項(xiàng)式方程實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行。最佳工藝條件為：提取溫度為90.8℃，水料比為21.3:1，提取時(shí)間為4.8h。在最佳條件下，實(shí)驗(yàn)的回收率為54.18%，與模型預(yù)測(cè)值匹配。此外，純化的多糖對(duì)DPPH自由基、羥自由基離子和超氧陰離子自由基有很強(qiáng)的抗氧化作用。[關(guān)鍵字]重樓優(yōu)化多糖抗氧化1.引言巴黎滇重

2、樓，廣泛分布在中國(guó)的西南地區(qū)，長(zhǎng)時(shí)間被作為中藥使用。它能有效的消腫、有效的減輕疼痛、消除咽喉腫痛、治療蛇毒咬傷和擦傷[1]。巴黎滇重樓中有許多生物活性成分，如皂甙，蛻皮激素，植物甾醇和黃酮甙[2]。它們被廣泛應(yīng)用于抗腫瘤、抗菌、止血和鎮(zhèn)痛[3]。多糖是高分子碳水化合物結(jié)構(gòu)，形成重復(fù)單元由糖苷鍵連接在一起[4]。因?yàn)槎嗵翘厥獾睦砘再|(zhì)和生物活性高，所以對(duì)多糖的研究受到了許多關(guān)注[5]。然而，一些研究已經(jīng)從云南滇重樓葉多糖（PPLPs)提取中開(kāi)展了。熱水提取技術(shù)是常用的植物多糖的提取方法，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于許多研究[6]。在提取過(guò)程中，提

3、取率是由多個(gè)獨(dú)立變量影響的。因此，開(kāi)發(fā)一個(gè)可以確定所有因素的優(yōu)化方法是必要的。另外，要確定最佳提取條件就應(yīng)該考慮自變量之間的相互作用。當(dāng)自變量有一個(gè)聯(lián)合的效果的時(shí)候，響應(yīng)面法（RSM）在優(yōu)化工藝方面是一種有效的統(tǒng)計(jì)技術(shù)。RSM的優(yōu)化過(guò)程比傳統(tǒng)方法需要較少的材料和時(shí)間[7]是一種典型的響應(yīng)面設(shè)計(jì)。在本設(shè)計(jì)中，處理結(jié)合在試驗(yàn)點(diǎn)，軸點(diǎn)，中心點(diǎn)。設(shè)計(jì)是旋轉(zhuǎn)（或接近旋轉(zhuǎn)），要求每一個(gè)因子五水平。與傳統(tǒng)方法相比CCD能更有效的進(jìn)行試驗(yàn)?；钚匝跏羌?xì)胞代謝過(guò)程中產(chǎn)生的副產(chǎn)品。過(guò)多的自由基會(huì)引起許多疾病，如癌癥、心血管疾病、動(dòng)脈粥樣硬化?？寡趸瘎┖桶?/p>

4、癥治療的常規(guī)藥物，如BHA、BHT和TBHQ的療效有限并且有顯著的毒性[8]。多糖是一種天然的生物大分子，廣泛存在于生物界中。因?yàn)槎嗵蔷哂锌寡趸?、抗癌和免疫活?dòng)，所以植物多糖引起了極大的關(guān)注。[9]。然而，很少資料是研究PPLPs的。本研究的目的是調(diào)查關(guān)鍵變量（提取溫度，提取時(shí)間和水料比）并進(jìn)一步優(yōu)化pplps的提取工藝。另外，對(duì)獲得純化的多糖及其抗氧化活性進(jìn)行了評(píng)價(jià)。2.材料與方法2.1材料和試劑將巴黎重樓葉干燥，將干燥的材料用粉碎機(jī)，然后過(guò)60目篩。將巴黎重樓葉粉末分別用石油醚（60-90℃）和乙醇在索氏抽提器中回流5小時(shí)。脫脂

5、后將粉末干燥，室溫下放置在干燥器中保存。乙醇，苯酚，硫酸，和葡萄糖分別來(lái)自成都科隆化工廠購(gòu)買(mǎi)。1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH），1,10-菲咯啉，,煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）和氮藍(lán)四唑（NBT）購(gòu)自西格瑪化學(xué)公司。所有化學(xué)試劑均為分析純。2.2提取pplps每個(gè)預(yù)處理粉末（1.0克），在設(shè)定的提取溫度，水料比和提取時(shí)間下萃取多糖。將所得的懸浮液通過(guò)離心（5000r/min,10分鐘）分離。收集上清液并加蒸餾水補(bǔ)至100ml。采用苯酚-硫酸法測(cè)定多糖的含量[10]。使用葡萄糖作為標(biāo)準(zhǔn)，并將結(jié)果表示為葡萄糖當(dāng)量。2.3實(shí)

6、驗(yàn)設(shè)計(jì)通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)確定提取變量的初步范圍。設(shè)計(jì)一個(gè)五水平三因素的CCD用于優(yōu)化pplps的提取率的最佳變量組合。分別選擇提取溫度（X1），水與原料的比例（X2），和提取時(shí)間（X3）用于多糖的提取率待優(yōu)化的獨(dú)立變量。三個(gè)變量和五個(gè)水平的范圍如表一所示。提取率（Y）被作為對(duì)三個(gè)變量在表2中的相互作用的響應(yīng)。根據(jù)等式三個(gè)變量進(jìn)行編碼：xi-x0Xi=i=1,2,3(1)△X其中X是獨(dú)立變量的編碼值，Xi獨(dú)立變量的實(shí)際值，X0是自變量的中心點(diǎn)的實(shí)際值，和γx為變量的階躍變化。該系統(tǒng)的行為由下列二次方程解釋：3323Y=A0+∑AiXi+∑

7、AiiXi+∑∑AijXij(2)i=1i=1i=1i=1其中Y是預(yù)測(cè)響應(yīng)，A0是一個(gè)常數(shù)，AI，AII和AIJ是由模型估計(jì)系數(shù)，以及XI和XJ是獨(dú)立變量。這些數(shù)值分別代表的是截距，線性，二次互動(dòng)變量的影響在響應(yīng)面中的情況。該模型評(píng)價(jià)三個(gè)變量的影響。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)三次。來(lái)估計(jì)自變量的響應(yīng)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行分析，并使用設(shè)計(jì)專家軟件預(yù)測(cè)的數(shù)據(jù)進(jìn)行了計(jì)算[11]。隨后，三個(gè)額外的實(shí)驗(yàn)以驗(yàn)證統(tǒng)計(jì)實(shí)驗(yàn)策略的有效性。2.4制備和多糖的純化取預(yù)處理的樣品（100.0g），采用優(yōu)化的條件下熱水提取方法提取PPLPs溶液。將懸浮液以5000rpm離心10

8、分鐘，并且將上清液收集并濃縮至約100毫升。濃縮液采用Sevag法除蛋白[12]。四體積的乙醇加入到濃縮物中，并將混合物在4℃保持12小時(shí)。收集沉淀物并真空干燥獲得PPLPsPPLPs（1.0克）溶解在去離子水中。該溶液通過(guò)DEAE-