棉花基因槍轉(zhuǎn)化體系的建立

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1、中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文引言表1部分棉花遺傳轉(zhuǎn)化Tab

2、ejPanofCollongenetictransformation轉(zhuǎn)化方法外源基因年代作者5中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文引言1．2．2．2基因槍轉(zhuǎn)化在棉花上的研究進(jìn)展基因槍轉(zhuǎn)化法沒有宿主范圍的限制，靶受體類型廣泛，是繼農(nóng)桿菌介導(dǎo)法之后應(yīng)用最廣泛的一項(xiàng)遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)。目前，已有眾多種植物采用基因槍轉(zhuǎn)化技術(shù)獲得了轉(zhuǎn)基因植株，水稻、玉米、小麥。等作物均獲得成功，該技術(shù)顯示了旺盛的生命力和廣泛的應(yīng)用前景。但雙子葉植物上較少應(yīng)用，作為重要的經(jīng)濟(jì)作物棉花，此項(xiàng)技術(shù)的應(yīng)用僅處于起步階段。John等(1990)第

3、一次將此技術(shù)應(yīng)用于棉花遺傳轉(zhuǎn)化中，他以胚性懸浮細(xì)胞系為受體進(jìn)行轟擊．成功得到轉(zhuǎn)化植株：之后，Dennis等(1993)首次采用莖尖分生組織為受體進(jìn)行轉(zhuǎn)化，得到了經(jīng)分子檢測的轉(zhuǎn)化植株。國內(nèi)，吳敬嗇等(1994)、朱衛(wèi)民等(1998)以棉花莖尖分生組織為受體均獲得了抗性轉(zhuǎn)化植株；郝秀英等(1999)以棉花下胚軸為受體作了轟擊探索。但以棉花幼胚、小孢子為受體進(jìn)行轟擊至今未見報(bào)道。(1)以莖尖分生組織為轟擊受體以莖尖分生組織為轟擊受體，通過器官再生完整植株的轉(zhuǎn)化方法，國外已有報(bào)道。國內(nèi)吳敬音、朱衛(wèi)民等也進(jìn)行了探索。此法最大的優(yōu)點(diǎn)是克服了農(nóng)桿菌宿主專一的限制，技

4、術(shù)直接，再生植株周期大大縮短，一般僅為6～16周即可得到轉(zhuǎn)基因植株。技術(shù)路線：適齡無菌苗培養(yǎng)—制備莖尖分生組織一轟擊一恢復(fù)培養(yǎng)一篩選培養(yǎng)(梯度篩選)一抗’眭轉(zhuǎn)化植株一分子檢測一嫁接一轉(zhuǎn)基因植株。Dennis等以棉花商業(yè)品種、海島棉(比馬S6)、陸地棉和無腺體棉等多種材料進(jìn)行了試驗(yàn)，晟后得到了正?？捎暮u棉和19個陸地棉轉(zhuǎn)化植株，轉(zhuǎn)化率為O．0270／o--4)．22％。他提出了“白抑現(xiàn)象”的理論，即當(dāng)莖尖分生組織在培養(yǎng)一段時間后，則生長緩慢、失綠甚至死亡。他的研究結(jié)果表明，莖尖內(nèi)部產(chǎn)生的ABA是造成此現(xiàn)象的原因之一。其改進(jìn)措施為：培養(yǎng)基中加入flur

5、idone(ABA合成的抑制劑)或檸檬酸，可以在一定程度上緩解此現(xiàn)象。另一有效措旌是：0．3％的活性炭交替使用，先將莖尖轉(zhuǎn)入含有活性炭的培養(yǎng)基，當(dāng)其生長緩慢時，再移入無活性炭的培養(yǎng)基上2～3周，之后再轉(zhuǎn)入含活性炭的培養(yǎng)基上，如此交替。可解決自抑現(xiàn)象。同時，活性炭還可以促進(jìn)莖尖自發(fā)生根。但之后的同類研究中，未涉及白抑現(xiàn)象，然而活性炭促生長和生根的作用是不可忽視的。CarylA等(1995)以NPTII為外源基因進(jìn)行了轉(zhuǎn)化。他對卡那霉素進(jìn)行了梯度實(shí)驗(yàn)(50、100、150、200mg／L)，以選取最適的濃度值。當(dāng)篩選壓為50m∥L時，非轉(zhuǎn)化植株失綠死亡，而

6、轉(zhuǎn)化植株的生長未受抑制；篩選壓為100mg／L時，莖尖分生組織生長緩慢；篩選／玉,>100mg／L時，莖尖分生組織不能正常生根長芽。因此，最適篩選壓為50m∥L。3個月內(nèi)得到了正?？捎脑偕D(zhuǎn)化植株，轉(zhuǎn)化率為O．885％。3．54％。吳敬音、朱衛(wèi)民等對篩選程序中～些環(huán)節(jié)作了研究．莖尖培養(yǎng)基MS不加或僅加少量激素6中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文引言優(yōu)于高激素的，莖尖分生組織附帶下胚軸長度為5—7mm為宜，最高篩選壓卡那霉素70—100mg／L，他們也得到了抗生素抗性的轉(zhuǎn)化植株，轉(zhuǎn)化率為3．300／r-4．10％。一般認(rèn)為，以莖尖分生組織為轟擊受體轉(zhuǎn)化率較低．

7、僅0．001“／04)．01％。而Agmw“(1997)、Gupta(1997)、Saeed(1997)、Hemphill(1998)和MOITe(1998)等提出的多莖尖誘導(dǎo)法，可在一定程度上提高基因槍轉(zhuǎn)化法的轉(zhuǎn)化效率。他們認(rèn)為，子葉節(jié)、初生葉和再生n’1-較頂端分生組織更敏感，利用外源激素調(diào)控可使其產(chǎn)生3．4。8．3個莖尖。John報(bào)道，此方法可使轉(zhuǎn)化率提高。另外，轉(zhuǎn)化率是基因槍轟擊過程中一系列綜合因素的最終結(jié)果．因此，欲提高轉(zhuǎn)化率必須使各參數(shù)達(dá)到最優(yōu)，即建立一個良好的轉(zhuǎn)化再生體系，這仍需要不斷研究與探索。值得注意的是：莖尖分生組織轉(zhuǎn)化中，極易產(chǎn)生

8、嵌合體。從解剖學(xué)角度講，莖尖分生組織分三層：L1、L2和L3層。基因槍轟擊時金屬粒子進(jìn)入L2和L3層后，可直接產(chǎn)生轉(zhuǎn)化細(xì)胞：而若進(jìn)入L1層，則僅表皮細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化，不能遺傳給后代。基因槍轉(zhuǎn)化法對莖尖分生組織的轉(zhuǎn)化常限于引起表皮細(xì)胞的變化。吳敬音也認(rèn)為，當(dāng)微粒轟擊莖尖分生組織時，只能有少數(shù)表層細(xì)胞被轉(zhuǎn)化，而多數(shù)細(xì)胞未被轉(zhuǎn)化，這種說法被普遍接受。而Trolinder(1988)提出的Spilt-medstemsMethod可以在一定程度上解決上述問題，其方法是劈開分生組織以暴露出L2層，增加L2和L3層被轉(zhuǎn)化的機(jī)會。但此方法操作性要求極高。目前實(shí)驗(yàn)中是通過加

9、強(qiáng)篩選壓力和延睦篩選時間，以保證轉(zhuǎn)化組織真正含有外源基因，減少嵌合體的數(shù)量。(2)以胚性細(xì)胞懸