不同劑量脂多糖預(yù)處理對(duì)哮喘小鼠肺部炎癥的影響的研究

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1、不同劑量脂多糖預(yù)處理對(duì)哮喘小鼠肺部炎癥的影響的研究李鴻佳,王淑娟,李艷麗,董亮【摘要】目的:研究不同劑量脂多糖(LPS)通過(guò)誘導(dǎo)肺泡巨噬細(xì)胞(AM)Toll樣受體4(TLR4)的高表達(dá),探討其對(duì)哮喘小鼠肺部炎癥的影響。方法:BALB/c小鼠隨機(jī)分為哮喘模型組(OVA)A,低劑量LPS處理組(0.1mg/LLPS+OVA)B,高劑量LPS處理組(100mg/LLPS+OVA)C,對(duì)照組(生理鹽水)D。用卵白蛋白(OVA)致敏與激發(fā)建立小鼠哮喘模型;酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)各組小鼠支氣管肺泡灌洗液(BALF)上清中IL4、IL5、IL13和IFNγ的含量,實(shí)時(shí)熒光定量PCR法測(cè)

2、定AM的TLR4的表達(dá),光鏡觀(guān)察肺組織病理變化。結(jié)果:與A組相比較,B組BALF上清中IL4、IL5和IL13的水平顯著增高(P0.05),而IFNγ差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),C組BALF上清中IL4、IL5和IL13的水平顯著降低,IFNγ顯著增高(P0.05);與A組相比,B組與C組AM的TLR4mRNA表達(dá)均明顯增高(P0.05),兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;光鏡下,A組支氣管黏膜下水腫,黏液腺增生,可見(jiàn)大量以嗜酸性粒細(xì)胞為主的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。B組與C組上述情況未見(jiàn)減輕,并出現(xiàn)肺泡腔及間質(zhì)充血,中性粒細(xì)胞等大量的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),D組管腔內(nèi)無(wú)黏液栓,氣道周?chē)鸁o(wú)炎癥細(xì)

3、胞浸潤(rùn),肺泡壁結(jié)構(gòu)完整。結(jié)論:低劑量LPS(0.1mg/L)誘導(dǎo)哮喘小鼠AM的TLR4高表達(dá),使肺部炎癥加重,而高劑量LPS(100mg/L)可能會(huì)減輕變態(tài)反應(yīng)癥狀。【關(guān)鍵詞】肺泡巨噬細(xì)胞;脂多糖;Toll樣受體4;支氣管哮喘支氣管哮喘(簡(jiǎn)稱(chēng)哮喘)是一種以嗜酸性粒細(xì)胞為主的眾多炎癥細(xì)胞和炎癥因子參與的慢性氣道炎癥性疾病〔1〕,其發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì),室內(nèi)灰塵,革蘭陰性桿菌的內(nèi)毒素等在哮喘氣道炎癥中的作用存在很大的爭(zhēng)議。脂多糖(LPS)是革蘭氏陰性細(xì)菌的一類(lèi)重要的病原體微生物成分,研究發(fā)現(xiàn),LPS濃度可影響Th1/Th2炎癥反應(yīng)。高水平LPS可使具有抗原特異性的Th1反應(yīng)增強(qiáng),低劑量LPS可使

4、Th2敏感性增高,提示LPS可能在過(guò)敏性炎癥反應(yīng)中具有獨(dú)特的雙向作用〔2〕。TLR4是LPS的主要模式識(shí)別受體,TLR4結(jié)合LPS等病原體相關(guān)分子模式后通過(guò)釋放細(xì)胞因子可促進(jìn)Th1細(xì)胞分化,從而可能在哮喘免疫和宿主保護(hù)中起重要作用,但目前尚沒(méi)有足夠證據(jù)證明TLR4能直接識(shí)別Th2型免疫應(yīng)答。我們?cè)噲D運(yùn)用不同劑量LPS干預(yù)小鼠哮喘模型,研究LPS誘導(dǎo)AM表面TLR4激活機(jī)制,探討TLR4激活在哮喘發(fā)病機(jī)制中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,進(jìn)一步明確其在哮喘小鼠氣道炎癥加重的機(jī)制中的作用。1材料和方法1.1材料雞卵蛋白(OVA,GradeV,純度>98%,Sigma),超純脂多糖(ultrapureLPS,E

5、.coliO111:B4,Sigma),BALB/c小鼠(6~8周齡,雌性)由山東大學(xué)試驗(yàn)動(dòng)物中心提供,小鼠IFNγ和IL4ELISA試劑盒購(gòu)自深圳晶美生物公司,小鼠IL5和IL13ELISA試劑盒購(gòu)自上海西唐生物公司,總RNA抽提與純化試劑盒購(gòu)自Roche公司,SYBRGreenΙ購(gòu)自Roche公司,SpectorΙ型酶標(biāo)分析儀(美國(guó))。1.2方法1.2.1動(dòng)物分組與模型建立將40只雌性BALB/c小鼠隨機(jī)分為4組,每組10只,A組為哮喘組,B組為低劑量LPS處理組(0.1mg/LLPS+OVA),C組為高劑量LPS處理組(100mg/LLPS+OVA),D組為生理鹽水對(duì)照組。A

6、組于第1(實(shí)驗(yàn)開(kāi)始當(dāng)天)、8d分別腹腔內(nèi)注射OVA混懸液每次50μg,〔OVA/AL(OH)3為10mg/g〕,第15天將小鼠置于自制的有機(jī)玻璃盒中,給予霧化吸入OVA(10g/LOVA/PBS),每天30min,連續(xù)1周。D組致敏與激發(fā)均以生理鹽水代替OVA。B組和C組分別在致敏階段每隔2d腹腔注射1mL含0.1、100μgE.coliLPS,激發(fā)階段在每次激發(fā)前1h腹腔注射相同劑量濃度E.coliLPS。各組小鼠在末次激發(fā)24h以后處死。1.2.2BALF標(biāo)本的收集對(duì)小鼠行氣管插管,在左主支氣管處結(jié)扎左肺,用3mL冰磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)分3次灌洗右肺,回收液體量>80%為合格,

7、約2.5mL/鼠,1000r/min,離心10min,4℃離心,收取各組細(xì)胞上清液,-80℃保存待測(cè)。1.2.3AM的分離與培養(yǎng)BALF離心后沉淀用生理鹽水3mL重懸、再離心,反復(fù)洗滌3次,然后用RPMI1640培養(yǎng)液(含2mmol/L谷胺酰氨,100mL/L胎牛血清,100U/L青霉素,100U/L鏈霉素)4mL混懸細(xì)胞,于孵箱中37℃、50mL/LCO2孵育2h后,輕輕吸出上清,去除非貼壁細(xì)胞。用含100

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