耐氨芐西林流感嗜血桿菌產(chǎn)β

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1、耐氨芐西林流感嗜血桿菌產(chǎn)β　　摘　要　目的：探討耐氨芐西林的流感嗜血桿菌產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶的機(jī)制。方法：對(duì)臨床分離的112株流感嗜血桿菌耐藥菌用紙片法作β-內(nèi)酰胺酶測(cè)定，用PCR法檢測(cè)產(chǎn)酶流感嗜血桿菌中的β-內(nèi)酰胺酶基因的存在。結(jié)果：紙片法測(cè)得產(chǎn)酶菌株32株，產(chǎn)酶率28.6％(32/112)；32株產(chǎn)酶菌中PCR法測(cè)β-內(nèi)酰胺酶基因陽(yáng)性菌株29株，陽(yáng)性率為90.6%(29/32)，其中質(zhì)粒DNA模板組陽(yáng)性為25株，基因組DNA模板組陽(yáng)性為4例。結(jié)論：(1)流感嗜血桿菌耐氨芐西林主要由質(zhì)粒介導(dǎo)產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶所造成。(2)PCR法是研究流感嗜血桿菌是否

2、攜帶β-內(nèi)酰胺酶基因及該基因所在位置的簡(jiǎn)便而有效的方法?！　∽?972年第一次發(fā)現(xiàn)流感嗜血桿菌因產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶而致耐氨芐西林以來(lái)［1］，國(guó)外對(duì)耐氨芐西林流感嗜血桿菌的耐藥機(jī)制以及產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶的分子基礎(chǔ)研究,呈逐年增加趨勢(shì)。1978年Bryan等［2］首次報(bào)道了質(zhì)粒介導(dǎo)產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶的流感嗜血桿菌。此后，圍繞流感嗜血桿菌中的質(zhì)粒編碼β-內(nèi)酰胺酶及其與耐氨芐西林的關(guān)系進(jìn)行了許多研究。我國(guó)由于流感嗜血桿菌的分離率較低，對(duì)此問(wèn)題的研究一直沒(méi)有深入。本文作者在本實(shí)驗(yàn)室成功提高流感嗜血桿菌分離率的基礎(chǔ)上［3,4］，分離獲得36株耐氨芐西林的流感嗜血桿菌，用

3、紙片法測(cè)定它們產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶的情況后，用PCR方法對(duì)產(chǎn)酶菌中β-內(nèi)酰胺酶基因的存在與否進(jìn)行了檢測(cè)，對(duì)耐氨芐西林的流感嗜血桿菌產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶機(jī)制作了初步分析。　　1　材料和方法　　1.1　流感嗜血桿菌的分離培養(yǎng)　收集痰或咽拭子標(biāo)本，于1h內(nèi)接種于改良的哥倫比亞巧克力瓊脂平板中，置5%CO2孵箱，37℃孵育18～24h,對(duì)疑似流感嗜血桿菌的菌落分別于血瓊脂和營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上作衛(wèi)星試驗(yàn)，僅在血瓊脂平板上衛(wèi)星試驗(yàn)陽(yáng)性者為流感嗜血桿菌。用常規(guī)的紙片法（K-B法）對(duì)每個(gè)菌株作體外藥物敏感試驗(yàn)，根據(jù)美國(guó)NCCLS標(biāo)準(zhǔn)判讀藥敏結(jié)果。從平板上挑取耐氨芐西林的單菌落接

4、種于含3ml液體HTM培養(yǎng)液的試管中，于5%CO2孵箱37℃孵育培養(yǎng)過(guò)夜，離心收集菌體用于質(zhì)粒制備等后續(xù)實(shí)驗(yàn)?！　?.2　紙片法測(cè)定β-內(nèi)酰胺酶　將流感嗜血桿菌培養(yǎng)物經(jīng)超聲裂解后直接涂布于β-內(nèi)酰胺酶紙片上，在15min內(nèi)變紅者為陽(yáng)性。超聲儀為BransonSonifier250，β-內(nèi)酰胺酶紙片購(gòu)自O(shè)xid公司?！　?.3　PCR法檢測(cè)β-內(nèi)酰胺酶基因　　1.3.1　PCR引物　針對(duì)β-內(nèi)酰胺酶結(jié)構(gòu)基因的PCR引物由本校分子遺傳學(xué)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室用PCGENE軟件PCRPLAN程序設(shè)計(jì)，上海生工生物工程公司協(xié)助合成。引物序列為：上游引物：5′TGGGT

5、GCACGAGTGGGTTAC3′，下游引物：5′TTATCCGCCTCCATCCAGTC3′?！　?.3.2　PCR反應(yīng)條件　用PE2400型DNA擴(kuò)增儀,50μlPCR反應(yīng)體系中含有模板DNA1μl、上游下游引物各1μl（濃度為25μmol/L），10×緩沖液5μl，dNTP混合物（10mmol/L）4μl，并用ddH2O補(bǔ)足至50μl（Mg2+的終濃度為1.5mmol/L），以94℃3min→(94℃1min→55℃1min→72℃1min，循環(huán)30次)→72℃7min→4℃保溫。PCR反應(yīng)后取10μl產(chǎn)物點(diǎn)樣，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳并拍照?！　?/p>

6、1.3.3　PCR模板的制備　細(xì)菌質(zhì)粒DNA用常規(guī)堿裂解法分離、RNaseⅠ消化、酚/氯仿抽提純化［3］；細(xì)菌基因組DNA用菌體凍融法制備：取少量細(xì)菌于1.5ml塑料離心管中，用蒸餾水重懸，加入少量溶菌酶于37℃水浴5min，放入液氮迅速冰凍5min，取出后立即放入37℃水箱融化5min，重復(fù)凍融3次，室溫下1×104r/min離心5min，吸取上清液到新的離心管，加入1.5倍體積的無(wú)水乙醇于-20℃沉淀30min，1.5×104r/min離心沉淀，用10μlTE溶解后備用?！　?　結(jié)　果　　2.1　流感嗜血桿菌的分離　自1997年10月至1998

7、年11月,從我院呼吸內(nèi)科及耳鼻咽喉科呼吸道感染患者中收集634份痰及咽拭子標(biāo)本，分離鑒定出112株流感嗜血桿菌,其中，藥敏試驗(yàn)證明為氨芐西林耐藥的36株?！　?.2　β-內(nèi)酰胺酶檢測(cè)結(jié)果　36株耐氨芐西林流感嗜血桿菌中，紙片法測(cè)得產(chǎn)酶菌株32株，耐藥菌中產(chǎn)酶率88.9%(32/36)?！　?.3　PCR法檢測(cè)β-內(nèi)酰胺酶基因結(jié)果　用針對(duì)β-內(nèi)酰胺酶基因的上游和下游特異性引物擴(kuò)增后，陽(yáng)性條帶大小為486bp，擴(kuò)增結(jié)果與預(yù)期值相同。32株產(chǎn)酶菌中PCR陽(yáng)性菌株29株，陽(yáng)性率為90.6%。其中以質(zhì)粒為模板PCR陽(yáng)性菌株25株，占產(chǎn)酶菌的78.1%（25/

8、32)；對(duì)7株質(zhì)粒DNA模板PCR陰性的菌株，以基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果有4株為陽(yáng)性。　　3　討　論　　國(guó)外