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《葡萄糖氧化酶活力測定(分光度法)》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關內容在行業(yè)資料-天天文庫。
1、葡萄糖氧化酶活力測定（分光度法）1.原理（1）葡萄糖氧化酶的催化特性：葡萄糖氧化酶的每個酶分子中含有兩單位FAD（黃素腺嘌呤二核苷酸），作為受氫體催化葡萄糖氧化生成葡萄糖酸，并產生過氧化氫。C6H12O6+O2=氧化酶C6H12O7+H2O2在一定時間內葡萄糖經氧化酶催化發(fā)生反應后，測定其反應液的過氧化氫濃度即可算出葡萄糖氧化酶的活力。（2）葡萄糖氧化酶催化葡萄糖氧化產生的過氧化氫在一定pH值的緩沖溶液中和加熱條件下能使靛藍胭脂紅發(fā)生褪色反應，并且其反應速度在一定范圍內和過氧化氫濃度成正比，據此測定出產生的過氧化氫的
2、量，進而計算出葡萄糖氧化酶活力。（3）首先利用一系列濃度的過氧化氫標準溶液與靛藍胭脂紅反應，在615nm波長處測定吸光度，建立標準曲線。然后，作葡萄糖氧化酶催化葡萄糖反應，再取其反應液與一定濃度的靛藍胭脂紅溶液反應隨后測定其在615nm波長處測定吸光度，將吸光度值代入標準曲線方程后可推算出氧化酶活力。2藥品（1）0.2mol/L葡萄糖溶液:稱取3.96g一水葡萄糖定容于100.00mL冷藏3小時備用，2天內有效。（2）1．0×10-3mol/L靛藍胭脂紅溶液：稱取0.466g靛藍胭脂紅定容于1000mL。（2）0.2
3、M醋酸-醋酸鈉緩沖溶液(pH=5.2)：稱取16.16g三水醋酸鈉及2.48g冰醋酸定容至1000mL（4）12mg/L過氧化氫標準溶液：準確稱取0.040g30%的過氧化氫溶液（過氧化氫需事先標定取實際值）定容于1000mL。3實驗方法（1）標準曲線的繪制準確吸取0、1、2、3、4、5、6mL過氧化氫標準溶液(12mg/L)，分別置于25mL比色管中，加人1.3mL靛藍胭脂紅溶液(1．0×10-3mol/L)和3．0mL乙酸一乙酸鈉緩沖液，再加人蒸餾水稀釋至25mL配成含有過氧化氫0.00mg/L、0.48mg/L
4、、0.96mg/L、1.44mg/L、1.92mg/L、2.40mg/L、2.88mg/L的溶液，于沸水浴中加熱13min后，用流水冷卻比色管5min。用1cm比色皿，以蒸餾水作參比，在波長615nm處測定其吸光度，以吸光度對過氧化氫濃度作圖（分光度作橫坐標，過氧化氫濃度為叢坐標）得標準曲線方程。（2）按酶活大小稱取適量葡萄糖氧化酶以醋酸-醋酸鈉緩沖液稀釋至約6U/mL的濃度，某些酶產品水溶性很差，加稀釋液混均定容好后需過濾取濾清夜測定。（3）將稀釋好的酶液置于37℃水浴中計時保溫5分鐘。（4）吸取2.00mL葡萄糖
5、溶液置于比色管中，將其放入37℃水浴中計時保溫5分鐘。（5）保溫時間到后吸取2.00mL酶稀釋液加入上述預放有2.00mL葡萄糖溶液的比色管中混勻，保溫反應10分鐘。（6）取出比色管轉置于冰浴中，同時取一25mL具塞比色管中，分別加入乙酸一乙酸鈉緩沖溶液3．0mL和1.3mL的靛紅溶液，再加入1mL的上述反應液，稀釋至刻度，于沸水浴中加熱13min后，取出用流水冷卻5min，終止反應。（7）用1cm比色皿，在波長615nm處，以蒸餾水作參比，測定其吸光度A0。（8）空白樣測定時，先加三氯醋酸后加酶稀釋液，其余各步湊相
6、同。4計算葡萄糖氧化酶活力定義為：37℃條件下，1min內催化葡萄糖反應產生1μg過氧化氫（H2O2）所需的酶量為1U。X0=（(A-A0)*K+C0）*25*10-3*103*（4/1）*（1/2）/10＝（(A-A0)*K+C0）*5X=X0*N/mX0：酶稀釋液的酶濃度，U/mLA：樣液的吸光度值A0：樣液的吸光度值K：標準曲線的斜率C0：標準曲線的截距25：反應液稀釋25倍10-3：單位換算，毫升轉為升103：單位換算，毫克轉為微克4/1：從4毫升反應液中吸取1毫升用于分光度測定1/2：取2毫升酶稀釋液用于測
7、定10：反應時間，分鐘X：葡萄糖氧化酶樣品的酶活，U/gN：酶粉的稀釋倍數m：稱取的酶粉重量，g
