豬支原體肺炎雙抗體夾心elisa方法的建立

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1、豬支原體肺炎雙抗體夾心ELISA方法的建立毛春玲陳欣王靜秦立鑫/哈藥集團生物疫苗有限公司豬肺炎支原體（MPS）是由豬支原體肺炎（Mhp）引起的豬地方流行性肺炎，該病是一種接觸性慢性呼吸道傳染病。豬只感染后會降低飼料轉(zhuǎn)化率，影響生長發(fā)育，并引起其他病毒及細菌的繼發(fā)感染。該病流行于世界各地，對養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)造成了嚴重的經(jīng)濟損失。（1）由豬肺炎支原體所引起的豬氣喘病普遍存在于養(yǎng)殖業(yè)發(fā)達的國家，該病一直以來是困擾我國養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的重要疾病。據(jù)統(tǒng)計，2010年我國生豬出欄近6億頭，90％以上養(yǎng)殖基地和規(guī)?；B(yǎng)豬場都存在著感染豬肺炎支原體的風(fēng)險，國內(nèi)該病的感染率可高達80%，是造成我國養(yǎng)豬

2、業(yè)經(jīng)濟損失的豬重要傳染病之一。由于本病同其他引起豬呼吸道的疾病表現(xiàn)出極為相似的臨床癥狀,并可與豬藍耳病病毒（Prrs）、豬圓環(huán)病毒2型（PCV2),胸膜肺炎放線桿菌（APP）等混合感染，并伴隨混合感染和繼發(fā)感染,增加了臨床診斷的難度。目前MhPs的診斷方法主要有：病原分離培養(yǎng)，間接血凝抑制（IHA）、補體結(jié)合試驗（CFT）、PCR、環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)(LAMP)等方法(4)。病毒分離耗時長：PCR、IHA、CFT、LAMP等方法對操作條件及人員有很高的要求，并且費用較高，均不適合在現(xiàn)地推廣。針對現(xiàn)地中檢測Mhp的情況，我們開展了建立雙抗體夾心ELISA檢測Mhp的研究，

3、以抗Mhp的兔多抗為捕獲抗體，抗MhPs的單克隆抗體3D6為檢測抗體，建立了具備較好的敏感性、特異性及重復(fù)性的雙抗體夾心ELISA方法。一、材料與實驗方法1.抗體制備?？筂hp的單抗3D6及抗Mhp的兔多抗由哈藥集團生物疫苗有限公司保存。將保存的單抗3D6及抗Mhp的兔多抗分別用GE公司的ProteinG和ProteinA試劑盒進行抗體純化，并用BCAProteinAssaykit對抗體濃度進行測定。按照測定結(jié)果，將單抗3D6用PBS的濃度調(diào)節(jié)為3ug/ml,用pH9.6的碳酸鹽溶液調(diào)節(jié)抗MhPS的兔多抗的濃度為5ug/ml。2.雙抗體夾心ELISA實驗方法。（1）將用

4、pH9.6的碳酸鹽溶液稀釋后的抗MhP兔多抗包被，每孔加入100μl,置4℃過夜，棄去孔中液體。（2）含0.5%Tin。（3）加入待檢測樣品和不含病毒的空白對照，37℃孵育1h。（4）棄去孔中液體，用含0.5%Tin。（5）加入調(diào)節(jié)好濃度的抗PRRSV的N蛋白的單抗3D6加入孔中，3ug/ml，每孔100ul，37℃孵育1h。（6）棄去孔中液體，用含0.5%Tin。(7)加入酶標(biāo)抗鼠抗體，37℃孵育40min。（8）棄去孔中液體，用含0.5%Tin。（9）加入TMB(四甲基聯(lián)苯胺)顯色液，每孔100ul，置37℃避光放置15min。最后加入2mol/l的H2SO4終止反

5、應(yīng)，測定OD450值。四、結(jié)果判斷根據(jù)對30份Mhp陰性血清的結(jié)果，其均值為0.098，標(biāo)準(zhǔn)差為0.014，得到其陰陽界限值為0.14，因此取OD450≥0.2作為陽性的判定標(biāo)準(zhǔn)。五、PCR檢測方法1.DNA提取。（1）取200mg待測樣品，放到1.5mlEP管中。（2）將待測樣品12000rpm離心2min。（3）沉淀物加入567ul的TE緩沖液，反復(fù)吹打使之重新懸浮，加入30ul10%SDS和15ul的蛋白酶K，混勻，于37℃溫育1h。（4）加入100ul5mol/LNaCl,充分混勻，再加入80ulCTAB/NaCl溶液，混勻后再65℃溫育10min。（5）加入等

6、體積的酚/氯仿/異戊醇混勻，離心4～5min,將上清轉(zhuǎn)入一只新管中，加入0.6～0.8倍體積的異丙醇，輕輕混合直到DNA沉淀下來，沉淀可稍加離心。（6）沉淀用1ml的70%乙醇洗滌后，離心棄乙醇。2.PCR。（1）25ul的反應(yīng)體系，冰上操作，稍后短時間離心。Template1ul/3ul、Primer11ul、Primer21ul、2×Master12.5ul、ddH2O補至25ul(9.5ul/7.5ul)。Primer1序列為5’-CCCCCATCCATGAAACCTATTAAAATACCTCTAATTCCT-3’Primer2序列為5’-CCCAAGCTTTTT

7、AAATATTTTTAATTGCATCTGATAAAT-3’（2）PCR循環(huán):①95℃5min、②94℃30s、③53℃60s、④72℃60s(從第2步開始循環(huán)30～35個循環(huán))、⑤72℃7min、⑥4℃PCR結(jié)束后-20℃保存或置于冰上開始電泳，目的片段大小為948bp。五、實驗方法評價1.敏感性試驗。將CCU檢測為1*107.0的Mhp的陽性樣品進行梯度稀釋，檢出的最低濃度定為該方法的靈敏度。2.重復(fù)性及特異性試驗。應(yīng)用該方法對20份陽性病料及10份陰性病料及5份Mhp菌液培養(yǎng)物進行重復(fù)，每次間隔時間為一周，共進行6次重復(fù)，結(jié)果均無差