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1、miR210在皮膚慢性潰瘍愈合中的作用湘潭市中心醫(yī)院湖南湘潭411100【摘要】目的：探究miR210在皮膚慢性潰瘍愈合中的作用。方法：選取我科皮膚慢性潰瘍患者，取其潰瘍組織進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)作為實(shí)驗(yàn)組，對(duì)照組為正常皮膚組織細(xì)胞,qRT-PCR法檢測(cè)兩組表皮細(xì)胞內(nèi)miR210相對(duì)表達(dá)量的變化；利用RNA干擾技術(shù)沉默miR210基因，轉(zhuǎn)染潰瘍細(xì)胞，CCK-8試劑盒檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞活性變化；結(jié)果:qRT-PCR法檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞12h、24h、48hmiRNA-210相對(duì)表達(dá)量分別為1.2、1.7、2.9,與對(duì)照組相比差異具有顯著性(P<0.05)；miRNA-2
2、10基因沉默后轉(zhuǎn)染細(xì)胞4h后，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞活力為0.75,轉(zhuǎn)染6h后活力下降為0.63,與對(duì)照組相比差異具有顯著性(P<0.05)。結(jié)論：皮膚潰瘍與miR210相對(duì)表達(dá)相關(guān)，且miR210沉默后能夠抑制受損細(xì)胞的活性，促進(jìn)潰瘍修復(fù)?！娟P(guān)鍵詞】miR210;皮膚慢性潰瘍；潰瘍愈合；RNA干擾隨著人口老齡化趨勢(shì)的增長(zhǎng)，慢性皮膚潰瘍發(fā)病率逐漸升高，臨床上治療周期長(zhǎng)，難以根治，且復(fù)發(fā)率高，嚴(yán)重影響患者的身心健康，因此如何有效治療慢性皮膚潰瘍是當(dāng)前的重要任務(wù)［1］。miRNA是一類皮膚調(diào)控因子通過(guò)與mRNA相結(jié)合調(diào)控相應(yīng)基因的表達(dá)，在維持皮膚更新、功能平衡和皮膚
3、損傷修復(fù)方面發(fā)揮著重要的調(diào)控作用［2］。miR210是一類缺氧相關(guān)miRNA,參與DNA損傷修復(fù)及細(xì)胞的增殖凋亡生理過(guò)程［3］。為研究miR210在皮膚慢性潰瘍愈合中的作用，選取我科皮膚慢性潰瘍患者潰瘍組織20份作為研究對(duì)象，通過(guò)RNA干擾技術(shù)沉默miR210基因后檢測(cè)miR210在皮膚慢性潰瘍愈合的分子機(jī)制，為治愈皮膚慢性潰瘍提供一定的理論基礎(chǔ)。1.實(shí)驗(yàn)材料1.1研究對(duì)象選取我院皮膚科皮膚慢性潰瘍患者20人作為研究對(duì)象1.2儀器與試劑含10%小牛血清、雙抗RPMI164培養(yǎng)基、胰蛋白酶購(gòu)自于美國(guó)Hyclone公司；Opti-MEM、DMEM培養(yǎng)基購(gòu)
4、自于上海拓然生物科技存限公司；Lipofectamine2000細(xì)胞轉(zhuǎn)漿試劑購(gòu)自于美網(wǎng)Invitrogen公司；2×SYBRGreenMix訂購(gòu)于Takara公司；CCK-8細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒購(gòu)自于美國(guó)同仁公司；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱、訂購(gòu)于美國(guó)Thermo公司，CFX96Real-TimePCR儀購(gòu)自于美國(guó)Bio-Rad公司。1.方法2.1細(xì)胞培養(yǎng)采集患者表皮潰瘍組織放入PBS溶液中，清洗3次，加入10%小牛血清的RPMI164培養(yǎng)基5mL,置于5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)數(shù)0達(dá)到80%,加入胰蛋白酶消化30min，小心吸取細(xì)胞液，
5、加入新鮮DMEM培養(yǎng)基，800rpm離心5min,收集細(xì)胞，按照1:3的比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)，第3代細(xì)胞可用于后續(xù)試驗(yàn)。1.2qRT-PCR法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)miRNA-210表達(dá)將收集后的細(xì)胞參照RNA提取和反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行細(xì)胞RNA提取和反轉(zhuǎn)錄，miRNA-210熒光定量引物序列為：F:S'-CGCAAGGATGACACGCAAAUR:S^-TTACCTAGCGTATCGTTGAd,以GADPH為內(nèi)參蘇序列為：F:5I-GGATGATGTTCTGGAAGAGCC-31R:5'-AACAGCCTCAAGATCATCAGC-3',反應(yīng)體系:lOuL2&time
6、s;SYBRGreenMix,上下游引物各luL,ddH208uL,10×cDNA模板luL。按照反應(yīng)程序95°C3min,94°C10s、60°C20s,72°C2min,30cycles,72°Cl0min。利用CFXmanager3.0軟件進(jìn)行Cq值分析，以GADPH作為內(nèi)參基因按照2-ΔΔCq算法進(jìn)行基因相對(duì)定量表達(dá)分析。1.3miRNA-210基因過(guò)表達(dá)后對(duì)細(xì)胞的抑制根據(jù)miRNA-210基因序列設(shè)計(jì)其siRNA引物：F:S^AATCTGTGCGTGTGACAG-S*,R：5'-TTACCTAGCGTAT
7、CGTTGAC-3',將2.5uLsiRNA、luLLipofectamine2000分別加入Opti-MEN培養(yǎng)基55ul中，靜置5min，混勻加入潰瘍組織細(xì)胞培養(yǎng)液中，反應(yīng)20min后，分別轉(zhuǎn)染4h、8h后，棄去轉(zhuǎn)染試劑，加入完全培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞。采用CCK-8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞活性，以未轉(zhuǎn)染的正常細(xì)胞為對(duì)照，計(jì)算細(xì)胞相對(duì)增殖活力。2.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS18.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析，計(jì)數(shù)資料采用率表示，采用檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。1.結(jié)果3.1qRT-PCR法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)miRNA-210相對(duì)基因表達(dá)細(xì)胞培養(yǎng)后12h、24
8、h后實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞內(nèi)miRNA-210相對(duì)表達(dá)量1.2、1.7，與對(duì)照組相比表達(dá)量有所升高，但差異不具有顯著性(
