黃芪多糖對(duì)糖尿病大鼠腎組織胰島素受體及其底物1的影響

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1、黃芪多糖對(duì)糖尿病大鼠腎組織胰島素受體及其底物1的影響【關(guān)鍵詞】黃芪多糖糖尿病腎病胰島素受體胰島素受體底物1糖尿病腎病(diabeticnephropathy，DN)發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，已有研究證實(shí)直接或間接與高血糖有關(guān)，糖尿病狀態(tài)下機(jī)體糖代謝嚴(yán)重障礙。胰島素（insulin，Ins）是調(diào)節(jié)糖代謝最主要的激素，其生物效應(yīng)由其靶細(xì)胞膜上胰島素受體(insulinreceptor,IR）介導(dǎo)，胰島素受體底物-1（insulinreceptorsubstrate-1,IRS1）是IR下游第一個(gè)底物分子，在其信號(hào)傳導(dǎo)

2、途徑中起著極其重要的作用，已有的研究表明糖尿病狀況下腎臟組織細(xì)胞膜胰島素受體的數(shù)目和親和力均存在異常［1，2］。本研究運(yùn)用黃芪多糖（APS）治療高脂飲食喂養(yǎng)加小劑量鏈脲佐菌素（STZ）注射誘導(dǎo)糖尿?。―iabetesMellitus，DM），擬進(jìn)一步觀察APS對(duì)糖尿病狀態(tài)下腎臟組織IR與IRS1蛋白表達(dá)的影響，探討其影響機(jī)制。　　1材料與方法　　1.1材料健康清潔級(jí)雄性SD大鼠40只，體重180～200g，由武漢大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。STZ，美國(guó)Sigma公司。APS溶液：APS從山西產(chǎn)黃芪根中提取制成粉劑，臨

3、用前用生理鹽水新鮮配制成20g/L的溶液。鼠IRS－1單克隆抗體，美國(guó)Neomarkers公司。兔InsR多克隆抗體，武漢博士德生物工程有限公司。SP試劑盒，北京中山生物技術(shù)公司。OnetouchⅡ血糖測(cè)定儀及試紙，美國(guó)JansonandJanson公司。切片機(jī)，國(guó)產(chǎn)LKB11800。顯微鏡，日本OlympasCH30。HPIAS1000型全自動(dòng)圖像分析系統(tǒng)。　　1.2方法　　1.2.1糖尿病模型的建立與分組　　實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為4組。正常對(duì)照組：給予普通飼料（60%碳水化合物，22%蛋白質(zhì)，10%豆油脂肪，包括

4、纖維素在內(nèi)的其他成分8%）喂養(yǎng)，用等體積生理鹽水灌胃處理5周。APS對(duì)照組：普通飼料，APS溶液［400mg/（kg·d）］灌胃處理5周。DM組：給予高脂飼料（41%脂肪，41%碳水化合物和18%蛋白質(zhì)），尾靜脈注射鏈脲佐菌素（STZ）（30mg/kgSTZ，溶于0.1mol/L檸檬酸緩沖鹽溶液，pH4.5），注射后動(dòng)物自由進(jìn)食，進(jìn)水并維持高脂飲食，STZ注射72h后，測(cè)動(dòng)物空腹血糖，大于6.7mmol/L者可診斷為糖尿病［3］。DM+APS組：空腹血糖大于6.7mmol/L的動(dòng)物繼續(xù)喂以高脂飼料，同時(shí)APS溶液

5、［400mg/（kg·d）］灌胃處理5周。　　1.2.2各項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)　　所有大鼠觀察毛發(fā)、活動(dòng)等情況，并取尾靜脈血測(cè)空腹血糖?！　?.2.3IR與IRS-1蛋白的檢測(cè)　　處死動(dòng)物后，取腎組織，4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，切片（4μm）；3%H2O2室溫孵育10min；5%～10%正常山羊血清封閉10min；加入一抗，37℃孵育1～2h；滴加生物素標(biāo)記的二抗，37℃10min；滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈卵白素，37℃10min；DAB顯色，室溫3min；蘇木素復(fù)染1min；酒精脫水；中性樹膠封片。免疫組化圖像分

6、析應(yīng)用高清晰彩色病理圖像免疫組化測(cè)量系統(tǒng)（HPIAS1000），經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)灰度校正后，隨機(jī)取5個(gè)視野，分別測(cè)定IR，IRS-1的平均光密度值（IDP）?！　?.2.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理　　采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,組間比較用t檢驗(yàn)。P<0.01有顯著性差異?！　?結(jié)果　　2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物一般情況　　DM大鼠毛發(fā)干枯、雜亂、脫落、蜷臥、活動(dòng)減少。給APS治療后，大鼠精神好轉(zhuǎn)、毛發(fā)光整、有色澤、活動(dòng)增多?！　?.2血糖如表所示，DM組和DM+APS組血糖水平均高于對(duì)照組，差別有顯

7、著性（P<0.01），DM+APS組血糖水平低于DM組，差別有顯著性（P<0.01）。胰島素經(jīng)血液循環(huán)到達(dá)相應(yīng)靶組織后，與其上的胰島素受體α亞單位相結(jié)合，激活其β亞單位的內(nèi)在激酶活性，導(dǎo)致IR自磷酸化。磷酸化的IR一方面為其它信號(hào)分子提供結(jié)合位點(diǎn)，另一方面其磷酸激酶可致IRS－1磷酸化。IRS－1被磷酸化后即暴露出特異性結(jié)合位點(diǎn)，能募集并激活含有SH2區(qū)域的蛋白質(zhì)激酶磷脂酰肌醇3激酶（PI3K），使信號(hào)以激酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)下傳。IRS－1通過(guò)激活PI3K激酶導(dǎo)致磷酸肌醇依賴的蛋白激酶（PDK1）的激活，后者

8、可使蛋白激酶B（PKB）磷酸化，活化的PDK1或磷酸化的PKB可導(dǎo)致葡萄糖轉(zhuǎn)移因子4（GLUT4）的合成、分泌、移位等變化［4，5］。GLUT4是直接影響葡萄糖入胞的細(xì)胞因子，對(duì)血糖的調(diào)節(jié)極其重要。現(xiàn)有資料表明，血糖的調(diào)節(jié)主要受IR/IRS－1/PI3K/PDK1/PKB/GLUT4信號(hào)途徑的影響，所以當(dāng)其信號(hào)徑路中IR和IRS發(fā)生障礙或異常時(shí)可導(dǎo)致糖尿?。?，5］。本實(shí)