pcr在臨床中醫(yī)學(xué)檢驗中應(yīng)用

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1、PCR在臨床中醫(yī)學(xué)檢驗中應(yīng)用陳楠（山東省威海市中國人民解放軍四零四醫(yī)院264200）【中圖分類號】R456【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A【文章編號】1672-5085（2013）05-0039-02聚合酶鏈反應(yīng)（簡稱PCR）是一種在體外擴增特異性DNA序列的技術(shù)1985年由Mullis發(fā)明,Salki等首先應(yīng)用于臨床，由于它在很短時問內(nèi)可使靶序列擴增2×105?106倍，具有快速、簡便、靈敏、及時、對樣品要求不高等優(yōu)點，所以其應(yīng)用范圍迅猛擴大，衍生出了多種新的PCR技術(shù)，如原位PCR技術(shù)、實時定量PCR技術(shù)、NASBA、TAS等，廣泛應(yīng)用于臨床的檢驗和科研工作中

2、，并極大地完善了檢驗技術(shù)，在臨床診斷和治療中的意義重大，在病原體鑒定、產(chǎn)前診斷等方面都作出了相應(yīng)的貢獻(xiàn)。1PCR技術(shù)的概述PCR是一種體外酶促合成特異DNA片段的方法，是分子生物學(xué)中最常用的技術(shù)。典型的PCR由①高溫變形、②低溫退火、③適溫延伸三個步驟，作為一個循環(huán)周期，多次循環(huán)反應(yīng)，使目的DNA得以迅速擴增，具有敏感性高、特異性強、操作簡便、快速省時等特點。其靈敏度可達(dá)到Pg級，甚至達(dá)到Fg級水平，而被擴增的基因片段能與原基因片段保持不變，技術(shù)操作簡便、快速而易掌握，并且對標(biāo)木要求不高。用過去的方法完成一項試驗少則幾周，多則幾個月。應(yīng)用全自動擴增儀，整個過程

3、均由電腦控制，只需數(shù)小時即可完成整個試驗過程,用極微量的粗制標(biāo)木就可獲取目的產(chǎn)物.檢驗醫(yī)學(xué)中的分子生物學(xué)技術(shù)有兩種發(fā)展趨勢：一是定量PCR,二是PCR的全自動化，如一次性試驗卡（將應(yīng)用擴增與檢測融于一體），可很好地解決PCR的污染問題。科學(xué)研究已證明，人類疾病大都直接或間接與基因有關(guān)?；蛟\斷被公認(rèn)為實驗診斷的發(fā)展方向。有專家認(rèn)為，實驗診斷經(jīng)歷了生化診斷、免疫診斷的發(fā)展階段，正進(jìn)入基因診斷的新時代。生化和免疫診斷是根據(jù)表型診斷疾病,基因診斷則是從木質(zhì)上認(rèn)識疾病。1995年，美國國家臨床檢驗標(biāo)準(zhǔn)化委員會(NCCLS)發(fā)表了關(guān)于感染性疾病分子診斷砬用準(zhǔn)則的文件。該

4、文詳細(xì)論述了分子診斷應(yīng)用范圍、條件和質(zhì)量控制細(xì)則［1］。NCCLS分子微生物委員會主席Enns斷言，以基因探針和基因擴增為主的分子生物學(xué)方法將取代傳統(tǒng)的病原體培養(yǎng)和生化檢測方法。1998年，國際臨床化學(xué)學(xué)會發(fā)布了關(guān)于分子擴增(主要指PCR)在臨床診斷中應(yīng)用的質(zhì)量評估基礎(chǔ)的文件。該文件肯定了PCR作為臨床常規(guī)檢驗技術(shù)的良好發(fā)展前景，對PCR操作的各個環(huán)節(jié)進(jìn)行了詳細(xì)論述［2］上述兩個權(quán)威性文件都特別聲明，以PCR技術(shù)為主的基因擴增技術(shù)本身在不斷發(fā)展變化，0前只能是確立某些原則，尚難統(tǒng)-規(guī)定實驗室質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。PCR的應(yīng)用在病原體鑒定方面的應(yīng)用1.10前，嗜肺軍團(tuán)菌

5、檢測方法主要有分離培養(yǎng)、血清學(xué)試驗、生化表型鑒定、脂肪酸成分分析、分子生物學(xué)檢測等。分離培養(yǎng)法作為檢測嗜肺軍團(tuán)菌的金標(biāo)準(zhǔn)，其特異性可達(dá)100%，但生長緩慢、耗吋長、需要營養(yǎng)條件苛刻，不適于快速檢測；血清學(xué)試驗簡便快速，但容易產(chǎn)生交叉反應(yīng)現(xiàn)象［3］;生化表型鑒定對試劑和儀器要求簡單，但只能初步鑒定一些特殊的種屬［4］;肪酸成分分析相對恒定，卻受細(xì)菌生長條件的影響［5］;分子生物學(xué)方法如隨機擴增多態(tài)性DNA(randomamplifiedpolymorphicDNA，RAPD)、串聯(lián)重復(fù)序列(MLVA)等，雖快速、敏感，但極易污染，缺乏統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)［6］。1.2結(jié)核

6、桿菌復(fù)合群IS6110基因序列、人型結(jié)核桿菌基因序列，分別設(shè)計合成特異性引物與探針，利用實吋熒光PCR對結(jié)核分枝桿菌病原菌進(jìn)行檢測，建立了結(jié)核病原菌的快速檢測方法。該方法具冇較高的靈敏性及特異性，與常用實驗室檢查方法痰涂片、組織活檢病理的陽性率及方法差異性進(jìn)行評估，明顯優(yōu)于傳統(tǒng)方法，且該方法對于支氣管肺泡灌洗液的檢測優(yōu)于痰，可以用于結(jié)核分枝桿菌檢測。1.3建立基于0抗原修飾基因的福氏志賀菌血清型PCR分型方法。針對0抗原合成基因wzx和0抗原的修飾基因gtrl，gtrlc,gtrll,oac,gtrIV，gtrV和gtrX設(shè)計引物，以常見的14種福氏志賀菌血清

7、型(包括la、lb、lc、2a、2b、3a、3b、4a、4b、5a、Y、X、Xv和F6）為標(biāo)準(zhǔn)菌株，建立福氏志賀菌血清型多重PCR。1.4特異引物PCR鑒定類鼻疽伯克霍爾德菌方法的建立和優(yōu)化此外應(yīng)用PCR方法從基因水平對細(xì)菌進(jìn)行檢測，必須正確選擇所要擴增的0的基因?，F(xiàn)提出以下方面的建議：（1）對所奮檢測細(xì)菌的相關(guān)基因及序列情況要了解。必要吋可進(jìn)行序列比較和檢索。（2）根據(jù)不同的檢測0的選擇相應(yīng)的模板。不同的菌種甚至不同的型別，其特征性基因的堿基排列順序就可能不冋。當(dāng)檢測不同的屬、種、株及血清型吋，根據(jù)序列情況，選擇與之相對應(yīng)特征的模板，如檢測沙門氏菌所選的模板

8、，則只能對沙門氏菌特異，而非沙門氏菌不