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1、Survivin反義核酸影響A549肺癌細(xì)胞增殖和凋亡的研究論文鄭人源蒲鈴玲劉樺潘克儉王玉明【摘要】目的研究Survivin反義寡核苷酸對(duì)A549細(xì)胞增殖和凋亡的影響。方法針對(duì)SurvivinmRNA序列設(shè)計(jì)了反義寡核甘酸，轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，PT-PCR檢測(cè)細(xì)胞中survivin基因的mRNA含量；TT法檢測(cè)細(xì)胞增殖，TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡。結(jié)果Survivin反義寡核苷酸可明顯降低A549細(xì)胞中survivin的mRNA和蛋白水平。MTT比色法結(jié)果說(shuō)明人Survivin反義寡核苷酸抑制A549細(xì)胞增殖，抑制率遠(yuǎn)高于無(wú)義寡核苷酸組和空白對(duì)照組。TUNEL法
2、檢測(cè)結(jié)果顯示，反義寡核苷酸還顯著增強(qiáng)A549細(xì)胞對(duì)抗腫瘤藥高三尖杉酯堿的敏感性，在較低高三尖杉酯堿濃度下，反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染細(xì)胞的凋亡率明顯高于其它對(duì)照組。結(jié)論survivin反義寡核苷酸有望應(yīng)用于腫瘤的輔助治療之中。【關(guān)鍵詞】Survivin；反義寡核苷酸；A549細(xì)胞；增殖；凋亡Abstract：ObjectiveToinvestigatetheeffectofsurvivinantisenseoligonucleotidetotheproliferationandapoptosisofA549cells.MethodsDesignedahumansurv
3、ivinantisenseoligonucleotidesandtransfecteditintoA549cells.TheexpressionofsurvivinmRNAandthelevelofproteinethodsrespectively.TheMTTassayeasuredbyTUNELassay.ResultsThequantityofsurvivinmRNAandthelevelofproteinuchhigherthantherateofthecontrol.Theapoptoticrateobtainedbytransfectingcel
4、lsoharringtonine.ConclusionTheexperimentresultsindicatethatantisenseoligonucleotidecandeserveasanapproachtosubservienttumortherapyinfuture.KeyRNA序列設(shè)計(jì)了反義寡核苷酸，抑制Survivin蛋白的合成，驗(yàn)證了Survivin反義寡核苷酸能抑制A549細(xì)胞增殖，提高細(xì)胞對(duì)抗腫瘤藥物高三尖杉酯堿（homoharringtonine,HHT）的敏感性。1材料與方法1.1試劑和細(xì)胞株A549肺癌細(xì)胞株由四川大學(xué)生命科學(xué)院細(xì)胞
5、生物學(xué)教研室贈(zèng)送。脂質(zhì)體LipofectamineTM2000購(gòu)自Invitrogen公司；MTT(噻唑藍(lán))購(gòu)自SantaCruz公司；兔抗Survivin多克隆抗體購(gòu)自SantaCruz公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自MBI公司；Tag聚合酶和TRIZOL試劑購(gòu)自Gibco公司；PVDF膜購(gòu)自Millipore公司；ECL試劑盒購(gòu)于博士德公司；細(xì)胞凋亡DNA片段原位末端標(biāo)記(TUNEL)試劑盒購(gòu)自BoehringerMannheim公司。高三尖杉酯堿購(gòu)于四川大學(xué)華西醫(yī)院藥房。1.2反義寡核苷酸應(yīng)用RNAstructure315對(duì)人survivinmRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)
6、行了模擬,依此設(shè)計(jì)并合成了反義寡核苷酸ASODN鏈和無(wú)義鏈，兩端各有5個(gè)堿基硫代修飾,由上海生工公司合成。反義寡核苷酸序列：5’-CCCAGCCTTCCAGCTCCTTG-3’無(wú)義寡核苷酸序列：5’-GCCACTCCTCGACTCTCGTG-3’1.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染A649細(xì)胞在含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，37℃,5%CO2中培養(yǎng),胰酶消化,計(jì)數(shù),分別接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(每孔細(xì)胞6000個(gè))和6孔板，37℃培養(yǎng)過(guò)夜,在LipofectamineTM2000脂質(zhì)體介導(dǎo)下進(jìn)行反義寡核苷酸和無(wú)義寡核苷酸的轉(zhuǎn)染,空白對(duì)照組孔內(nèi)加入含相同濃度脂質(zhì)體的RPM
7、I1640培養(yǎng)液。6h后移去含脂質(zhì)體的培養(yǎng)液，換為含10%血清的RPMI1640培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。1.4RT-PCR檢測(cè)TRIZOL法提取6孔板內(nèi)細(xì)胞的總RNA，用紫外分光光度儀定量；各樣本取1μg總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，取cDNA5μl/樣本，加SurvivinPCR引物，同時(shí)加入β-actin引物作為內(nèi)對(duì)照，雙引物常規(guī)PCR反應(yīng)，25個(gè)循環(huán)。瓊脂糖電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。1.5TT法檢測(cè)細(xì)胞增殖細(xì)胞轉(zhuǎn)染后,繼續(xù)在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)24、48、72h；在以上時(shí)段分別加入MTT，測(cè)其A490值,.freelol/L。每組均設(shè)8個(gè)平行孔(取平均值作為1次實(shí)驗(yàn)結(jié)果),并
8、重復(fù)3次(批)實(shí)驗(yàn)。反義寡核苷酸對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率=
