sirna沉默hif1α在缺氧狀態(tài)下對(duì)食管鱗癌細(xì)胞vegf表達(dá)的影響論文

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1、siRNA沉默HIF1α在缺氧狀態(tài)下對(duì)食管鱗癌細(xì)胞VEGF表達(dá)的影響論文吳欣愛，孫燕，樊青霞，王留興，王瑞林，趙培榮，張嵐【摘要】目的觀察體外乏氧培養(yǎng)條件下食管鱗癌細(xì)胞系EC9706中HIF1α和VEGF的表達(dá)，探討HIF1α在低氧條件下對(duì)食管鱗癌血管生成的調(diào)控作用。方法CoCl2化學(xué)缺氧法模擬腫瘤缺氧環(huán)境.freelRNA和蛋白水平的表達(dá)。采用化學(xué)合成小干擾RNA（siRNA）介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù)（RNAi）用siRNA轉(zhuǎn)染EC9706細(xì)胞。觀察轉(zhuǎn)染后HIF1α沉默效果。結(jié)果低氧條件下，EC9706細(xì)胞HIF1αmRNA水平穩(wěn)定，蛋白表達(dá)顯著

2、升高，而VEGFmRNA和蛋白的表達(dá)均顯著升高。SiRNA轉(zhuǎn)染EC9706后能夠顯著下調(diào)HIF1α的基因表達(dá)，同時(shí)VEGF基因的表達(dá)也受到明顯抑制。結(jié)論缺氧促使EC9706細(xì)胞HIF1α在蛋白水平表達(dá)升高，并通過轉(zhuǎn)錄激活VEGF的機(jī)制調(diào)控食管鱗癌血管生成?！娟P(guān)鍵詞】食管鱗癌;乏氧誘導(dǎo)因子1α;血管內(nèi)皮生長因子;雙鏈RNA;RNA干擾惡性腫瘤快速生長和腫瘤內(nèi)部血液供應(yīng)相對(duì)不足導(dǎo)致腫瘤內(nèi)部形成缺氧微環(huán)境。低氧是實(shí)體腫瘤微環(huán)境的基本特征之一。缺氧條件下，腫瘤細(xì)胞內(nèi)許多基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)發(fā)生變化，對(duì)缺氧作出應(yīng)激反應(yīng)。引起腫瘤的侵襲性增加和對(duì)放化療的抗拒性增加

3、，而在這個(gè)過程中轉(zhuǎn)錄因子乏氧誘導(dǎo)因子1（hypoxiainduciblefactor1alpha,HIF1α）起中樞紐帶作用1。乏氧引起的一些酶或因子的變化大多是通過HIF1α起作用。其在食管癌血管生成中的調(diào)控作用，尚未見詳細(xì)報(bào)道。本研究以食管鱗癌細(xì)胞系EC9706為研究對(duì)象，通過體外模擬腫瘤缺氧微環(huán)境，利用RNA干擾技術(shù)觀察小干擾RNA轉(zhuǎn)染EC9706細(xì)胞前后低氧條件下HIF1α和VEGF的表達(dá)，初步探討HIF1α在缺氧條件下對(duì)食管癌血管生成的調(diào)控作用。1材料和方法1.1材料食管鱗癌細(xì)胞系EC9706由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所分子腫瘤學(xué)國家

4、重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)王明榮教授惠贈(zèng)。HIF1αsiRNA(h)、ControlsiRNAA、siRNA轉(zhuǎn)染試劑及HIF1α抗體均購自SantaCruz公司。RTPCR試劑盒購自大連寶生物工程有限公司，VEGF抗體購自武漢博士德公司，SP免疫組化試劑盒購自北京中杉生物技術(shù)公司1.2方法1.2.1細(xì)胞體外乏氧培養(yǎng)條件的建立EC9706細(xì)胞用含10%新生牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。化學(xué)缺氧劑CoCl2加入培養(yǎng)基的終濃度為75μmol/L，用于模擬腫瘤內(nèi)部缺氧微環(huán)境。1.2.2半定量RTPCR檢測mRNA表達(dá)EC9706細(xì)胞于

5、低氧條件下培養(yǎng)8h，Trizol法提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系（20μl）組成為：DEPC水7μl，5×Buffer4μl，dNTPs（10nM）2μl，Oligo（dT）1μl，RNase抑制劑1μl，總RNA4μl，逆轉(zhuǎn)錄酶1μl，37℃5min，42℃1h，70℃10min滅活逆轉(zhuǎn)錄酶。PCR引物序列如下：HIF1α上游5′CCTGCACTCAATCAAGAAGTTGC3′，下游5′TTCCTGCTCTGTTTGGTGAGGCT3′（618bp）；VEGF上游5′CACATAGGAGAGATGAGC3′，下游5′CCGCCTCG

6、GCTTGTCACA3′（230bp）；βactin上游5’CATCCTGCGTCTGACCT3’,下游5’TCAGGAGGAGCAATGATCTTG3’(480bp)。2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物，數(shù)碼照相并行灰度值分析。1.2.3免疫組化SP法檢測低氧條件下HIF1、VEGF蛋白的表達(dá)缺氧處理8h后收獲細(xì)胞爬片，4%多聚甲醛固定10min，按照試劑盒說明進(jìn)行。HIF1α、VEGF多克隆抗體購自武漢博士德生物工程有限公司，SP試劑盒購自中杉生物技術(shù)有限公司。1.2.4siRNA轉(zhuǎn)染EC9706細(xì)胞轉(zhuǎn)染前24h以4×105/ml密度接

7、種細(xì)胞于6孔培養(yǎng)板，待細(xì)胞生長至60%～70%融合時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。按試劑盒說明進(jìn)行。分別設(shè)siRNA轉(zhuǎn)染組及ControlsiRNA組。轉(zhuǎn)染32h后，更換含化學(xué)缺氧劑CoCl2培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)8h，收集細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測。1.2.5HIF1α基因沉默效果的測定低氧培養(yǎng)4、8h后，分別提取未轉(zhuǎn)染組、轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照組和轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞蛋白考馬斯亮藍(lán)蛋白定量。10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白后，380V轉(zhuǎn)移30min，凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，5%脫脂奶粉封閉過夜，加入HIF1α抗（1∶1000稀釋），37℃孵育2h，PBS漂洗，在封閉液中加入

8、辣根酶標(biāo)記的羊抗兔二抗，37℃孵育1h，PBS漂洗。最后用ECLPLUS試劑孵