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《水蛭提取物對(duì)人肝癌hepg2細(xì)胞體外抑制作用研究論文》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在工程資料-天天文庫。
1、水蛭提取物對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞體外抑制作用研究論文.freelg/mL時(shí),對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞的增殖有明顯抑制作用,細(xì)胞數(shù)目明顯下降,并呈劑量依賴性,與水提醇沉法提取物比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。吖啶橙染色可見典型的凋亡細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征。結(jié)論水蛭液氮快速凍融法提取物可體外抑制HepG2細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)凋亡,其作用明顯優(yōu)于水蛭水提醇沉法提取物?！娟P(guān)鍵詞】肝癌HepG2細(xì)胞；水蛭提取物；增殖；凋亡；液氮快速凍融法Abstract：ObjectiveTostudytheinhibitioneff
2、ectofleechextractonHepG2cells.MethodsHumanhepatocellularcancercelllineHepG2ethodoffreeze-thaethodoforphousinedbyMTTassayandAcridineorange(AO)fluorescentstainingmethodrespectively.ResultThe6～15mg/mLdrugconcentrationsofleechextractbymethodoffreeze-thaanner
3、,andtheeffectethodoforphologicalfeaturesofapoptoticcellsethodoffreeze-thaethodofaHepG2cells；leechextract；proliferation；apoptosis；freeze-thaa公司產(chǎn)品。1.3藥物水蛭原藥材購于湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,并由湖南省中醫(yī)研究院超微工程中心制備成水蛭超微粉。提取物以液氮快速凍融法和常規(guī)水提醇沉法制備2-3。液氮快速凍融法：取水蛭超微粉1.5g置15mL離心管內(nèi),加10mL
4、滅菌雙蒸水制成混懸液,再將離心管置液氮內(nèi)5min,取出,立即放入37℃水浴中迅速融解,重復(fù)3次,3000r/min離心10min,取上清液過濾,濾液冷凍干燥18h即得水蛭凍干粉,-20℃保存?zhèn)溆谩Ｋ岽汲练ǎ喝∷纬⒎?5g,加10倍水煎煮1h,過濾,重復(fù)3次,合并濾液并濃縮成2g/mL,加95%乙醇,使含醇量至75%,靜置過夜,回收乙醇,粉碎成細(xì)粉,-20℃保存?zhèn)溆?。臨用前以培養(yǎng)基配成實(shí)驗(yàn)所需濃度工作液,0.22μm濾器正壓過濾除菌。1.4四甲基偶氮唑鹽試驗(yàn)人肝癌HepG2細(xì)胞以1×l04個(gè)/孔接種
5、于96孔培養(yǎng)板中,然后加入不同濃度的水蛭提取物工作液,使其終濃度分別為3、6、9、12、15mg/mL,同時(shí)設(shè)置對(duì)照孔,加等體積的DMEM培養(yǎng)基。37℃、5%CO2培養(yǎng)48h后,每孔加入5mg/mLMTT工作液20μL,再孵育4h,去上清,加入二甲基亞砜150μL/孔,旋渦振蕩器振蕩充分溶解結(jié)晶,酶標(biāo)儀492nm波長(zhǎng)處測(cè)定每孔的吸光度值(OD),每組重復(fù)5孔,計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率(對(duì)照組OD值－藥物組OD值)/對(duì)照組OD值×100%。1.5繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線人肝癌HepG2細(xì)胞以1×l05個(gè)/孔接種于6孔培
6、養(yǎng)板中,然后加入不同濃度的水蛭提取物工作液,設(shè)置對(duì)照孔,加等體積的DMEM培養(yǎng)基。倒置顯微鏡下觀察各藥物濃度水蛭提取物對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞形態(tài)的影響及生長(zhǎng)情況,干預(yù)24、48、72h時(shí),2.5g/L胰蛋白酶消化收集細(xì)胞,血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù),每孔重復(fù)3次,取平均值繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。1.6吖啶橙熒光染色各濃度藥物干預(yù)培養(yǎng)于蓋玻片上的人肝癌HepG2細(xì)胞48h后,95%乙醇固定,0.01%AO染液中染色,封片后置熒光顯微鏡(激發(fā)波長(zhǎng)405nm)下觀察。1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用x±s表示,應(yīng)用SPSS11.5統(tǒng)
7、計(jì)學(xué)軟件包分析處理。組內(nèi)比較采用單因素方差分析,組間比較采用成組t檢驗(yàn)。2結(jié)果2.1水蛭提取物對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞增殖的抑制作用(見表1)表1水蛭提取物對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞增殖的影響(略)注：與對(duì)照組比較,*P＜0.05,**P＜0.01；與3mg/mL水蛭組比較,##P＜0.012.2細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察及細(xì)胞計(jì)數(shù)6～15mg/mL濃度水蛭液氮快速凍融法提取物作用于人肝癌HepG2細(xì)胞48h后,可觀察到細(xì)胞萎縮變圓,出現(xiàn)漂浮細(xì)胞碎片與凋亡小體,生長(zhǎng)緩慢,細(xì)胞數(shù)量明顯減少,其中9～15mg/mL藥物濃度細(xì)
8、胞數(shù)目明顯下降,至72h時(shí),12～15mg/mL藥物濃度細(xì)胞基本死亡。水蛭水提醇沉法提取物15mg/mL時(shí)才出現(xiàn)細(xì)胞數(shù)目緩慢下降。2.3熒光顯微鏡觀測(cè)細(xì)胞凋亡形態(tài)經(jīng)AO染色后,對(duì)照組細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰,胞膜完整,核仁清晰,胞質(zhì)清晰,呈黃綠色熒光。水蛭液氮快速凍融法提取物處理后,細(xì)胞體積明顯變小,細(xì)胞外形皺折,胞膜不完整,結(jié)構(gòu)模糊,凋亡細(xì)胞核染色質(zhì)呈黃綠色濃聚在核膜內(nèi)側(cè),可見細(xì)胞膜呈泡狀膨出及凋亡小體。水蛭水提醇沉法提取物作用后15mg/mL高濃度
