臍血間充質(zhì)干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化的培養(yǎng)研究論文

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1、臍血間充質(zhì)干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化的培養(yǎng)研究論文【摘要】目的臍血間充質(zhì)干細(xì)胞（HumanumbilicalcordbloodMarroalStemCells，MSCs）在體外特定環(huán)境下誘導(dǎo)為脂肪細(xì)胞。方法分離培養(yǎng)MSCs，加入特定誘導(dǎo)液，觀察MSCs的形態(tài)變化，并在誘導(dǎo)第14d后用油紅O染色檢測(cè)MSCs中含有橙黃色脂滴細(xì)胞比例，并與單純低糖DMEM培養(yǎng)的MSCs為對(duì)照組。結(jié)果在特定微環(huán)境中的MSCs誘導(dǎo)培養(yǎng)72h后出現(xiàn)脂滴，第20d時(shí)觀察80%臍血MSCs在油紅O染色示向脂肪細(xì)胞分化。對(duì)照組MSCs未見(jiàn)明顯變化，油紅0染色呈陰性結(jié)果。結(jié)論在特定環(huán)境下MSCs可分化為脂肪細(xì)胞.freelesenc

2、hymalstemcells,MSCs)于1976年由Fridenshtein首次發(fā)現(xiàn)，是一種具有多分化潛能的成體干細(xì)胞，存在于人類(lèi)等生物的骨髓等組織中,具有向骨、軟骨、脂肪、神經(jīng)元和肌肉及肌腱等組織分化的潛能［1,2］。研究發(fā)現(xiàn)臍血中含有MSC，與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有相同的多向分化和造血支持功能3,4。臍血間充質(zhì)干細(xì)胞與其他來(lái)源的干細(xì)胞相比具有免疫原性弱,來(lái)源廣泛,采集方便，更強(qiáng)的增殖能力和無(wú)倫理問(wèn)題等諸多優(yōu)點(diǎn)。目前臍血間充質(zhì)干細(xì)胞作為多種疾病治療的細(xì)胞來(lái)源,在臨床應(yīng)用方面具有廣闊的前景。我們的實(shí)驗(yàn)分離培養(yǎng)臍血MSCs，并向脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)化的研究,了解MSCs誘導(dǎo)分化前后的生物學(xué)特征,為組織工

3、程研究方面奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，為骨質(zhì)疏松、代謝綜合癥等疾病的發(fā)病機(jī)制提供細(xì)胞模型。2材料和方法2.1材料所有臍血取自解放軍401醫(yī)院婦產(chǎn)科，征得病人及其家屬同意。低糖型DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司；胎牛血清(FBS)購(gòu)自杭州四季青生物工程公司；1-甲基-3-異丁-2黃嘌呤（IBMX）、地塞米松和胰島素、Percoll分離液、油紅O染料購(gòu)自上?；瘜W(xué)品采購(gòu)公司。CD44、CD34單克隆抗體購(gòu)于Neomarker公司。2.2方法2.2.1臍血MSCs的分離培養(yǎng)參照國(guó)外4成熟分離方法，在無(wú)菌條件下抽取臍血3ml，肝素抗凝后與3mlPBS混勻，然后按1：1的比例緩慢加入3ml的percoll淋巴細(xì)胞分層

4、液(1.073g/ml)中，2000轉(zhuǎn)/min離心10分鐘，取白膜層，PBS沖洗稀釋后1000轉(zhuǎn)/min離心10分鐘，共2次。離心后的沉淀細(xì)胞加入5%FBS的LG-DMEM制成單細(xì)胞懸液后接種于培養(yǎng)瓶中,37℃，5%CO2培養(yǎng)箱下培養(yǎng)，24h細(xì)胞貼壁,呈圓形形狀生長(zhǎng)。72小時(shí)后細(xì)胞呈紡錘形或多角形，每2-3天換液1次，當(dāng)細(xì)胞匯合85%時(shí)胰蛋白酶消化按1∶3比例傳代。第3～4代以后,細(xì)胞形態(tài)開(kāi)始比較均一。2.2.2臍血MSCs透射電鏡樣本制備取第3代臍血MSCs制成單細(xì)胞懸液，2.5%戊二醛固定，4℃過(guò)夜。PBS洗滌，1%鋨酸固定，梯度乙醇脫水，環(huán)氧丙烷浸透，Epon812包埋并聚合，常規(guī)超薄

5、切片。醋酸雙氧鈾及枸櫞酸鉛雙染色。透射電鏡下觀察。2.2.3MSCs細(xì)胞向脂肪細(xì)胞的誘導(dǎo)培養(yǎng)我們配置了含1-甲基-3-異丁-2黃嘌呤(IBMX)、地塞米松、胰島素、和胎牛血清的培養(yǎng)基誘導(dǎo)液誘導(dǎo)臍血MSCs向脂肪細(xì)胞分化。6孔板每孔接種1×106個(gè)細(xì)胞，標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基培養(yǎng)24h后換成脂肪誘導(dǎo)基質(zhì)(含10%FBS，1μmol/L地塞米松,.freell胰島素,0.5mmol/LIBMX)，每3d換液1次。油紅O為特異性的脂質(zhì)結(jié)合劑，在第3周時(shí)來(lái)檢測(cè)脂肪沉積。PBS液洗滌誘導(dǎo)后細(xì)胞，10%中性緩沖甲醛固定20～30min，60%異丙醇漂洗去除多余染液，蒸餾水沖洗10min。光鏡下觀察,隨機(jī)抽取計(jì)數(shù)10

6、個(gè)非重疊視野(×100),計(jì)算脂肪細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的比例。結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x-±s)表示。單純的LG-DMEM培養(yǎng)，每3～4d換液。3結(jié)果分離臍血得到的白膜層接種到培養(yǎng)瓶中在第2～3天時(shí)貼壁，兩端有較長(zhǎng)突起，胞核橢圓形，細(xì)胞增殖生長(zhǎng),形成集落，起初生長(zhǎng)緩慢，2周左右達(dá)到90%匯合。細(xì)胞形態(tài)呈現(xiàn)多元化，有的呈小圓形、星形，有的體積較大有多個(gè)核，多數(shù)在傳代后死亡，形態(tài)與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞相似，隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞體積逐漸增大伸展。圖1第3代的臍血MSCs圖2第3代臍血MSCs電鏡結(jié)果3.1臍血MSCs的鑒定在透射電鏡觀察胞核類(lèi)圓形，核仁明顯核膜有核袋及核突，有些細(xì)胞呈現(xiàn)1～2個(gè)核仁，在核膜周?chē)?/p>

7、染色質(zhì)排列。胞質(zhì)中有多量的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體、微管等。貼于蓋玻片表面的細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形突起較長(zhǎng)，細(xì)胞表面有微絨毛。3.2誘導(dǎo)組與對(duì)照組結(jié)果第3d誘導(dǎo)組中可觀察到臍血MSCs的由扁平漸收縮變小，圓形胞體外形成突起，細(xì)胞逐漸變成圓形（圖2），胞突起逐漸變圓鈍，胞漿內(nèi)出現(xiàn)類(lèi)似脂滴樣物質(zhì)。第7天后高折光性的脂滴沉著細(xì)胞數(shù)目逐漸增多，第20d油紅O染色示胞核呈藍(lán)色,脂滴呈橙色（圖3），絕大多數(shù)脂肪細(xì)胞的脂肪顆粒充滿(mǎn)整個(gè)細(xì)胞