脫鎂葉綠酸的制備及其光敏抗菌活性

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1、脫鎂葉綠酸的制備及其光敏抗菌活性作者：唐蕾徐磊韓躍毛洪【摘要】以初步純化的葉綠素為原料，利用葉綠素酶水解、選擇性酸降解兩種方法制備脫鎂葉綠酸。高效液相色譜分析顯示兩種方法得到的產(chǎn)物圖譜相似，酸降解產(chǎn)物中脫鎂葉綠酸A的含量較高?？咕鷮?shí)驗(yàn)表明脫鎂葉綠酸對(duì)革蘭陽(yáng)性菌具有光敏抑菌效果，對(duì)革蘭陰性菌和酵母無(wú)明顯作用?！娟P(guān)鍵詞】脫鎂葉綠酸；葉綠素酶；高效液相色譜；光敏抗菌活性ABSTRACTPartiallypurifiedchlorophyllethods.Highperformanceliquidchromatographyanalys

2、isshoethod.Theantimicrobialtestshopositivebacteria.KEYicrococcustetraglnus)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtillis)、北京棒桿菌(Corynebacteriumpekinese)、白葡萄球菌(Staphylococcusalbus)、大腸埃希菌(Escherichiacoli)。均為實(shí)驗(yàn)室保藏菌種。1.2培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件酵母培養(yǎng)基酵母膏5g，蛋白胨10g，葡萄糖20g，定容至1000ml，pH6.0。細(xì)菌培養(yǎng)基NaCl5g，蛋白胨10g，牛肉膏

3、3g，定容至1000ml，pH7.0。121℃滅菌20min。培養(yǎng)溫度酵母28℃，細(xì)菌37℃，光照為培養(yǎng)箱內(nèi)置光源。1.3抗菌實(shí)驗(yàn)(1)在固體平板上均勻涂布200μl菌液，取10μl待測(cè)樣品溶液于直徑6mm的濾紙片上，稍干后貼于已接菌的瓊脂培養(yǎng)基表面，光照條件下恒溫培養(yǎng)24h，觀察、記錄抑菌圈大小，并與陽(yáng)性對(duì)照藥物(細(xì)菌為氨芐西林，酵母為放線菌酮)相比較，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。(2)將待測(cè)菌在含有50μg/ml的Pheide培養(yǎng)基上十字劃線，比較光、暗條件對(duì)微生物生長(zhǎng)的影響，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。1.4葉綠素的提取參照Iriyama

4、法［7］，從菠菜中提取和純化葉綠素，丙酮溶解，測(cè)定溶液在645和663nm處的吸光值，按照Arnon公式計(jì)算葉綠素含量：ChlA(mg/ml)=0.0127A663-0.00269A645ChlB(mg/ml)=0.0229A645-0.00468A6631.5脫鎂葉綠酸的制備(1)酶解法采集新鮮的豌豆葉，洗凈晾干，在冷丙酮中勻漿后過(guò)濾，濾物用冷丙酮漂洗并干燥。1g過(guò)濾物用25mL磷酸緩沖液(20mmol/L，pH7.0，內(nèi)含0.24%TritonX100)攪拌抽提4.5h，在8000r/min，4℃條件下離心10min，上清

5、液即為所需葉綠素酶酶液。葉綠素酶酶液中蛋白含量的測(cè)定采用雙縮脲法。葉綠素酶溶液、20mmol/L磷酸緩沖液和0.15mg/ml葉綠素充分混勻(該反應(yīng)體系中蛋白質(zhì)終濃度為3.2μg/μl、丙酮40%、TritonX1000.60%，pH7.0)，在37℃恒溫水浴中12h反應(yīng)完全后，加入正己烷∶丙酮∶10mmol/LKOH(3∶2∶1)渦漩混勻，在8000r/min，4℃的條件下離心10min。取下層并加入幾滴鹽酸酸化即得到脫鎂葉綠酸溶液，4℃冰箱避光保存。(2)酸解法采用Hynninen選擇性酸法水解［6］，鹽酸乙醚分級(jí)分離，

6、將醚層中的溶劑揮發(fā)，得到的脫鎂葉綠酸溶于丙酮中，4℃冰箱避光保存。1.6高效液相色譜條件色譜柱為Eclipse×DBC18(150mm×3.0mm，5μm)；流動(dòng)相為95%甲醇溶液(色譜純)；流速0.8ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)430nm。2結(jié)果與討論2.1脫鎂葉綠酸的制備脫鎂葉綠酸作為天然卟啉是葉綠素降解的中間產(chǎn)物，在茶葉、柑橘、老化葉中普遍存在，但含量低，分離困難。一般通過(guò)葉綠素酶催化，植醇基水解，得到脫植醇葉綠素，繼而酸化得到脫鎂脫植醇葉綠酸即PhEide(圖1)。由于疏水性植醇基的去除，PhEIde的親水性大大增加，可以通

7、過(guò)液液分離將底物Chl與產(chǎn)物Pheide分離。由于ChlA和ChlB同時(shí)可以作為葉綠素酶的底物，因而產(chǎn)物中除PheideA外還常含有少量的PheideB。Hynninen等［6］根據(jù)ChlA、B植醇基水解能力的不同，開(kāi)發(fā)了直接從ChlA、B混合物通過(guò)選擇性酸降解制備PheideA的方法。圖2為菠菜色素的粗提液，經(jīng)過(guò)Iriyama法純化得到ChlA、B，和選擇性酸降解產(chǎn)物的薄層層析結(jié)果。得到的產(chǎn)物條帶經(jīng)質(zhì)譜分析顯示分子量為592與PheideA一致。高效液相色譜是檢測(cè)葉綠素、類(lèi)胡蘿卜素、葉黃素等色素的常用分析手段，本研究用反相高效

8、液相色譜，選擇葉綠素和類(lèi)胡蘿卜素的檢測(cè)波長(zhǎng)430nm比較兩種制備方法，圖譜顯示兩者的結(jié)果相似，其中選擇性酸降解的純度較高(圖3)。2.2脫鎂葉綠酸抗菌實(shí)驗(yàn)我們首先選擇實(shí)驗(yàn)室保存的5種細(xì)菌和6種酵母進(jìn)行了光敏抑菌實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明脫鎂葉綠酸對(duì)革蘭陽(yáng)性菌有明顯的抑菌作用