《聚合酶鏈反應》word版

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1、PCR引物的優(yōu)化設計聚合酶鏈反應(polymerasechainreaction,PCR)通過多循環(huán)的變性、退火和延伸過程，能夠在時間內(nèi)獲得大量目的DNA片段，稱為一種無細胞分子克隆技術，已經(jīng)成為短生命科學實驗室獲取目的DNA片段的常規(guī)方法。聚合酶鏈反應(polymerasechainreaction,PCR)是用于在體外酶促擴增特定DNA片段的快速方法。像分子克隆技術一樣，PCR方法使得許多以前不可能的實驗得以完成，PCR的應用似乎是無止境的，并正在不斷地擴展，其中包括從基因組DNA和cDNA直接克隆目的基因，體外誘變和

2、DNA工程，對法醫(yī)樣品進行的遺傳指紋鑒定，傳染病原的分析，遺傳疾病的產(chǎn)前診斷，基因的等位序列變異分析，RNA轉錄物結構的分析，基因組足跡分析以及對基因組DNA和cDNA進行直接核苷酸序列測定。同時相關的技術也突飛猛進地發(fā)展。PCR方法的廣泛應用及其相關的技術的順利進行均離不開PCR引物的合理設計?？梢哉f，PCR引物的合理設計是任何PCR反應能否進行及其產(chǎn)物的特異性、產(chǎn)率高低的關鍵。目前許多計算機軟件可用于引物的設計，但由于各種計算機軟件自身存在的局限性，其設計的引物并無法滿足實驗者不同需要。目前最常用的是計算機輔助設計，即

3、實驗者根據(jù)PCR引物設計的原則并結合自己的經(jīng)驗人工設計引物，然后選擇合適的軟件分析引物的合理性。引物設計原則：2．1原則PCR引物設計的目的是為了找到一對合適的寡核昔酸片段，其中在擴增的DNA片斷5’端的引物對應于有意鏈DNA序列，3’端的引物對應于無意鏈DNA序列，使其能有效地擴增模板DNA序列。因此，引物的優(yōu)劣直接關系到PCR的特異性與成功與否。要設計引物首先要找到DNA序列的保守區(qū)。同時應預測將要擴增的片段單鏈是否形成二級結構。若這個區(qū)域單鏈能形成二級結構，就要避開它。如這一段不能形成二級結構，那就可以在這一區(qū)域設計

4、引物。1.根據(jù)實驗需要，確定需要擴增的DNA序列，并知道其CDS區(qū)序列（編碼結構基因區(qū),即從起始密碼子區(qū)至終止密碼子區(qū)）ncbi網(wǎng)站查詢2.選擇所需的載體,確定合適的酶切位點。所選擇的酶切位點盡量為多克隆位點的中間酶切位點，且載體上其它地方無該酶切位點。這樣連接以后再構建新的質粒時選擇酶的空間更大些。并保證所需擴增的DNA序列中無該酶切位點（generunr分析）。4.正向引物的設計4.1酶切位點的位置選擇。一般情況下都需要在引物的5’，3’端增加酶切位點，然后利用該酶將擴增產(chǎn)物切下，接到相應的載體上。A：擴增的DNA用于

5、表達時：(1)自身有啟動子。如果要利用自身的啟動子，擴增片段里應包含啟動子，所以酶切位點應該在啟動子前面?？稍谒鶖U增的DNA序列的啟動子前尋找是否有該酶切位點，若有則直接利用該酶切位點進行擴增；若無可尋找與其基本相似的位點進行擴增。(2)擴增片段里自身無啟動子。對于自身無啟動子而又用于表達的基因序列，必須將其接于外源啟動子的后面才能順利表達。在翻譯過程中，mRNA必須首先與核糖體相結合才能進行蛋白質合成。在原核生物中，mRNA分子上有兩個核糖體結合位點，一個是起始密碼子AUG，另外一個是起始密碼子AUG上游3bp-11bp

6、處的3bp-9bp的序列，后者由ShineJ及DalgarnoL發(fā)現(xiàn)，故稱為SD序列。SD序列富含嘌呤核苷酸，而16SrRNA3’端富含嘧啶核苷酸，二者剛好互補，可促進mRNA核糖體結合，提高翻譯效率。因此，在基因重組過程中應將結構基因接于SD序列之后，以便為mRNA提供核糖體結合位點，提高基因表達效率。起始密碼子與SD序列之間核苷酸數(shù)量變化過大會影響翻譯效率，所以應該將目的基因的起始密碼子與啟動子的ATG相重疊，這樣才能保證起始密碼子與SD序列之間核苷酸數(shù)量不改變，不影響翻譯效率。一般的啟動子3’斷酶切位點是NcoI（C

7、CATGG）或NdeI(CATATG)，若添加的酶切位點為NdeI，引物的5’端酶切位點設計為NdeI即可；若添加的酶切位點為NcoI時,應該根據(jù)目的基因起始密碼子后的堿基種類的不同選擇不同的酶切位點：如果該堿基是G，則可以直接設計為NcoI位點；如果該堿基不是G（如擴增的目的基因為5’-aagtcgtatgactaccgttcccgatctcga-3’）因為NcoI位點ATG后的G與DNA起始密碼子后的a不配對，所以在設計引物的酶切位點時不能象上例簡單地設計為NcoI。在處理這個問題上有三種方法：一種是直接設計為NcoI

8、位點,其缺點是改變了閱讀框的第一個氨基酸，可能對表達會有影響；為了保證原始的閱讀框，可采取以下兩種方法：第二種方法是利用同尾酶連接法，即在保證起始密碼子及其后的堿基不改變的情況下選擇合適的酶切位點。如上例將引物的酶切位點設計為tcatga（BspHI的酶切位點）,這樣既保證了閱讀框的atga堿基，又因為