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《神經干細胞移植治療大鼠脊髓損傷的活體示蹤研究論文》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關內容在工程資料-天天文庫。
1、神經干細胞移植治療大鼠脊髓損傷的活體示蹤研究論文張立峰，茅祖斌，蔣贊利【摘要】目的：探索利用MR技術活體追蹤干細胞的可行性及神經干細胞(NSCs)移植對大鼠脊髓損傷(SCI)后功能恢復的影響。方法：66只SD大鼠隨機分為假損傷組（A組）、SCI對照組（B組）和細胞移植治療組（C組）3組，應用已包被多聚左旋賴氨酸(PLL)的SPIO標記NSCs,對標記細胞進行普魯士藍染色，分別在細胞移植后第1、2、3、4、5周對各組動物進行BBB評分，細胞移植后1、3、5周行MRI檢查。結果：(1)普魯士藍染色證實該方法標記NSC
2、s的有效率為100%。（2）細胞移植后1～5周,B、C組動物運動功能均有不同程度恢復，但B組恢復較慢，BBB評分差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。（3）1.5TMRI檢查見移植處在T2R技術活體追蹤干細胞的可行性以及NSCs移植對SCI大鼠后肢功能恢復的影響。1材料與方法1.1胎鼠來源NSCs的制備、培養(yǎng)與鑒定［3］取胚齡14dSD大鼠胚胎的大腦腦室下區(qū)組織并吹打成單個細胞,.freell－1種瓶,用DMEM/F12(1∶1)無血清培養(yǎng)基［內含bFGF20ng·ml－1、EGF20ng·ml－1、B2720ng·
3、ml－1］培養(yǎng)。每6～7d換液、傳代1次。對第2代細胞作免疫組化鑒定：取無血清培養(yǎng)基貼壁分化培養(yǎng)24h的蓋玻片1張,4%多聚甲醛固定30min。0.25%Triton-100破膜12min,然后用5%脫脂奶粉封閉特異性抗原,室溫孵育30min,吸干殘液滴加1∶500小鼠抗大鼠nestinIgG1(一抗),4℃孵育過夜。第2天滴加FITC標記的羊抗小鼠IgG1二抗,室溫孵育1h,然后50%緩沖甘油封氣,熒光顯微鏡下觀察并攝像。1.2NSCs的標記和染色細胞傳至第3代,取適量已包被多聚左旋賴氨酸(poly-L-lys
4、ine,PLL)的SPIO加入10mlDMEM/F12培養(yǎng)基中,37℃振蕩60min,使SPIO終濃度為25μg·ml－1,將消化的細胞沉淀加入含SPIO的培養(yǎng)基中孵育12h完成標記。NSCs標記后普魯士藍染色:標記后的NSCs換成含10％血清的DMEM/F12培養(yǎng)液，置6孔板中培養(yǎng)7d，去掉培養(yǎng)液，PBS洗滌3遍，4%多聚甲醛固定30min,PBS洗滌3遍,含2％亞鐵氰化鉀的6％鹽酸溶液常溫孵育30min,顯微鏡下觀察。1.3實驗動物分組與SCI模型的制作66只成年雄性SD大鼠,體重250～300g,隨機分為假
5、損傷組(A組，6只)、SCI對照組(B組，30只)及細胞移植治療組(C組，30只)3組。B、C兩組參照改良的Allen重物打擊法［4］制作大鼠脊髓背側損傷模型：實驗前大鼠禁食8h，用戊巴比妥鈉(30g·L－1)按40mg·kg－1腹腔注射麻醉,背部脫毛后俯臥位固定于動物手術臺上,常規(guī)消毒,腰背部正中切口,逐層分開顯露T8～T10椎板,行T9全椎板切除,顯露硬脊膜,鉗夾固定T8及T10棘突,用10.0g的不銹鋼棒(直徑為2.5mm)沿帶有刻度的玻璃導管從25mm高處垂直下落,打擊在由塑料材料制成的底部呈凹面、直徑為
6、3mm的撞桿上,后者將打擊力傳遞給脊髓,造成大鼠脊髓不完全損傷,致傷后迅速移開打擊物,逐層縫合。模型成功的判斷標準:打擊后損傷處脊髓出血、水腫，大鼠出現擺尾反射,雙下肢及軀體回縮樣撲動,麻醉清醒后雙下肢呈弛緩性癱瘓。A組僅行T9全椎板切除術作對照。術后即刻腹腔注射5%葡萄糖鹽水2ml,以補充血容量。予青霉素鈉鹽5萬U背外側肌群肌肉注射預防感染,每天1次,持續(xù)3d。注意保溫,分籠飼養(yǎng),自由取食,每天8：00及20：00行膀胱按摩協(xié)助排尿,直至建立反射性排尿。1.4細胞移植將第3代懸浮培養(yǎng)的NSCs懸液用臺式離心機離
7、心5min(1000r·min－1),將細胞團以少量培養(yǎng)液吹勻,細胞計數為105μl－1。C組動物SCI后9d于損傷節(jié)段下0.5cm處用5μl微量注射器以與脊髓水平面呈30°角刺入脊髓組織中,注入2μlNSCs懸液,逐層縫合切口。1.5運動功能評分BBB評分［5］為總分21分的運動功能評分,考察大鼠后肢的運動、軀干的位置和穩(wěn)定性、步態(tài)、協(xié)調性、爪的置放、足趾間隙及尾的位置,表示SCI后大鼠后肢運動功能恢復的過程。BBB評分簡單直觀,易于掌握,與脊髓功能恢復有極好的一致性。分別在動物移植前第7天和移植后1、2、3、
8、4、5周進行盲法BBB評分,由兩名熟悉BBB評分標準的非實驗人員觀察。將動物置于直徑1m的平面光滑場地自由活動5min,記錄動物后肢運動情況。1.6MR檢查于術后第1、3、5周分別行MR檢查，掃描序列為T2RI將SPIO標記的NSCs移植到C組SCI下位1周后行1.5TMR檢查,見移植處在T2RI可以提供25～50μm的分辨率,接近單一細胞的水平,使其理論上可以用來對移植
