原位雜交檢測cycline在皮膚血管瘤組織中的表達(dá)

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1、原位雜交檢測cyclinE在皮膚血管瘤組織中的表達(dá)【摘要】目的:探討細(xì)胞周期素E（cyclinE）在皮膚血管瘤組織中的表達(dá)及臨床意義。方法:采用原位雜交方法檢測人皮膚血管瘤增生期、退化期及正常皮膚組織血管內(nèi)皮細(xì)胞的cyclinEmRNA表達(dá)水平，利用圖像分析技術(shù)檢測不同時期血管瘤和正常皮膚組織的陽性面積率和平均光密度。結(jié)果:增生期血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞cyclinEmRNA表達(dá)水平明顯高于退化期及正常皮膚組織，差異有顯著性意義（P<0.01）;退化期與正常皮膚組織血管內(nèi)皮細(xì)胞cyclinEmRNA表達(dá)水平差異無顯著性意義（P>0.05）。結(jié)論:細(xì)胞周期

2、素E在血管瘤的發(fā)生中起了重要的作用?！娟P(guān)鍵詞】原位雜交;血管瘤;細(xì)胞周期素E;陽性面積率;平均光密度　　血管瘤是嬰幼兒中發(fā)病率最高的一種以內(nèi)皮細(xì)胞異常增殖為組織學(xué)特征的腫瘤。新生兒患病率為1.1%～3.8%，至1歲時可高達(dá)10%。目前成人病例也呈逐漸上升趨勢。雖然部分血管瘤可以自行消退，但仍有部分未退化的血管瘤可持續(xù)發(fā)展或其生長部位特殊而具有一定的危險性，如果位于顏面、顱內(nèi)及口腔可引起明顯的畸形及功能障礙，如持續(xù)發(fā)展可產(chǎn)生潰瘍、出血、感染等一系列并發(fā)癥。臨床治療尤其對于大面積血管瘤的治療尚缺乏確切、迅速有效的方法。雖然血管瘤各期的組織形態(tài)學(xué)特征已經(jīng)通過免疫

3、組織化學(xué)方法鑒定出來，但其發(fā)病機(jī)制尚不清楚，因此，也難以尋找到一種有效的治療手段。細(xì)胞周期素E（cyclinE）是細(xì)胞周期重要的調(diào)節(jié)因子，cyclinE與特定的細(xì)胞周期依賴性激酶（cyclindepen-dentkinases，CDKs）構(gòu)成復(fù)合體，可以使底物磷酸化，啟動DNA的合成，CDK抑制蛋白（cyclin-dependentkinaseinhibi-torprotEins，CKIs）能夠抑制cyclinE的活性。不同的物質(zhì)可以通過與CKIs之間直接或間接的相互作用影響cyclinE的表達(dá)，這些相互作用對闡明腫瘤發(fā)生的機(jī)制是非常重要的，而且可以為大量

4、常見的腫瘤提供預(yù)后的信息。我們采用原位雜交方法檢測人皮膚血管瘤增生期、退化期及正常皮膚組織血管內(nèi)皮細(xì)胞的cyclinEmRNA表達(dá)水平，并利用圖像分析技術(shù)檢測不同時期血管瘤和正常皮膚組織的陽性面積率和平均光密度，探討細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子cyclinE在血管瘤發(fā)生中的作用?！　?材料　　1.1材料來源收集武漢大學(xué)人民醫(yī)院病理科2002～2005年皮膚血管瘤存檔蠟塊50例，其中男性26例，女性24例，年齡2月～18歲。血管瘤位于頭皮、眼瞼、耳部、頸部、胸部、上臂、手部及大腿等部位。患者術(shù)前均未做任何輔助性治療?！　?.2材料分組蠟塊切片厚5um，常規(guī)HE染色和原位

5、雜交方法檢測血管瘤組織中cyclinEmRNA的表達(dá)。按Mulliken分類標(biāo)準(zhǔn)將切片分組，其中增生期血管瘤24例，退化期血管瘤26例。另取瘤組織周圍正常皮膚5例作為對照。　　　　2實驗方法　　2.1常規(guī)HE染色　　2.2原位雜交①常規(guī)脫蠟至水。用3%H2O2室溫處理10min以滅活內(nèi)源性過氧化物酶。②用2滴細(xì)胞打孔液將組織切片浸泡10～40min，0.1MPBS室溫5min洗3次，用無RNA酶處理過的濾紙吸干。③暴露mRNA核酸片段:切片上滴1滴復(fù)合消化液，37℃消化5～20min。④0.5MPBS洗3次×5min。蒸餾水洗1次，用無RNA酶處理過的濾紙

6、吸干。⑤預(yù)雜交:干的雜交盒底部，加5～10ml蒸餾水。每張切片加20ul（或1滴）預(yù)雜交液，將原位雜交專用蓋玻片的保護(hù)膜揭開后，蓋在切片上，置于4℃雜交過夜。用2×SSC洗滌5min×3次，用無RNA酶處理過的濾紙吸干。⑥雜交:干的雜交盒底部，加5～10ml蒸餾水。每張切片加10～20ul（或1滴）含寡核苷酸探針的原位雜交液，將原位雜交專用蓋玻片的保護(hù)膜揭開后，蓋在切片上。恒溫箱37℃雜交4～5h。⑦雜交后洗滌:揭掉蓋玻片，30～37℃左右水溫的2×SSC洗滌5min×3次。用無RNA酶處理過的濾紙吸干。⑧滴加SA-HRP:37℃20min或20℃左右30

7、min。0.5MPBS洗5min×4次，用無RNA酶處理過的濾紙吸干。⑨DAB顯色:滴加1滴預(yù)先配制混勻的DAB顯色試劑至標(biāo)本上，顯色5～15分鐘。⑩酒精脫水，二甲苯透明，封片?！　?.3圖像分析處理將血管瘤增生期、退化期以及正常皮膚組織的切片置O-LYMPUS顯微鏡下（400×），對所測視野進(jìn)行準(zhǔn)確定位后由攝像系統(tǒng)提取數(shù)值化細(xì)胞圖像輸入HPIAS-1000多媒體彩色病理圖像分析系統(tǒng)（同濟(jì)千屏影像公司）進(jìn)行處理，每例隨機(jī)選取5個完整而不重疊的視野進(jìn)行定量分析，測定免疫組化反應(yīng)陽性顆粒的平均光密度和面積的百分率，取每張切片的均值作為該例的測量值?！　?.4統(tǒng)

8、計學(xué)方法用SPSS11.5統(tǒng)計軟件對3組樣本陽性顆粒的平均光密度和