中華按蚊多態(tài)微衛(wèi)星dna位點的篩選和特征研究論文

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1、中華按蚊多態(tài)微衛(wèi)星DNA位點的篩選和特征研究論文【摘要】目的：對中華按蚊多態(tài)的微衛(wèi)星DNA位點進行分離和篩選，并闡明其特征.方法：應用中華按蚊基因組DNA的酶切片段與生物素標記的寡核苷酸探針雜交，親合素富集和超濾離心濃縮目的片段，擴增放大，克隆并測序，構建中華按蚊微衛(wèi)星DNA庫.在其中挑選合適的微衛(wèi)星位點，建立擴增體系.應用中華按蚊現(xiàn)場樣本擴增不同的微衛(wèi)星位點，聚丙烯酰胺凝膠電泳篩選具有多態(tài)性的微衛(wèi)星位點.結果：構建的中華按蚊微衛(wèi)星DNA庫中包含252條序列.freelann,1828）在我國分布廣且種群數量大，是以往文獻記載中瘧疾和絲蟲病的重要傳播媒介［4-5］.本研究

2、擬構建中華按蚊的微衛(wèi)星DNA庫并篩選其中多態(tài)的微衛(wèi)星位點，為中華按蚊基因組學研究積累基礎資料，并為其相關研究提供新的分子標志.1材料和方法1.1材料構建中華按蚊微衛(wèi)星DNA庫的樣本為上海實驗室品系，由中國疾病預防控制中心寄生蟲病預防控制所提供.現(xiàn)場中華按蚊采自云南思茅（200508，n=10）、云南鹽津（200607，n=10）和湖北武漢（200607，n=10），選擇雌性成蟲為實驗材料.1.2方法1.2.1微衛(wèi)星DNA庫構建基因組DNA的抽提參照Hammond等的文獻進行［6］，-20℃保存待用.基因組DNA經Sau3AI酶切，回收200～800bp的片段，加SA

3、UL接頭連接，接頭序列如下：SAULA：GCGGTACCCGGGAAGCTTGG，SAULB：GATCCCAAGCTTCCGGGTACCGC.以SAULA為引物，連接產物作為模板PCR擴增，反應液中含PCR緩沖液、2.5mmol/LMgCl2，0.2mmol/LdNTP，0.8μmol/L引物，0.6UTaq酶（上海生工生物工程有限公司）和2μL模板，在熱循環(huán)儀（PTC100，美國ABI公司）上執(zhí)行如下程序：72℃5min后，94℃1min，67℃1min和72℃2min共32個循環(huán)，72℃延伸5min.將擴增產物變性后，與Biotin16ddUTP（瑞士Roc

4、he公司）標記的寡核苷酸探針雜交，探針包括：(AAT)17，(GA)25，(CCT)17，(AC)25，(CAG)17，(CAC)5，(TC)10，(GT)8和(TG)18.用親和素VectrexAvidinD（英國VectorLabs公司）捕獲并超濾離心（美國Millipore公司）濃縮富集雜交的目的片段.以富集的核酸作為模板，SAULA為引物擴增，反應體系和程序同前.隨后，用PCR產物再次雜交、捕獲、濃縮富集和擴增.將上述擴增產物插入TOPOT載體（美國Invitrogene公司），轉化E.coliJM109，挑選含微衛(wèi)星DNA序列的陽性克隆，用四色熒光標記雙脫氧鏈

5、終止法測序（PEABI3770全自動測序儀，上海英駿生物技術有限公司），應用BioEdit（Version5.0.9）軟件包分析所獲序列.1.2.2微衛(wèi)星DNA多態(tài)位點篩選單蚊抽提現(xiàn)場中華按蚊基因組DNA，參照文獻進行分子鑒別確認蚊種為中華按蚊［7］.選擇22條重復次數較多，且典型的微衛(wèi)星DNA序列，應用Primer3（Version3.1）軟件包設計引物.以單蚊基因組DNA為模板，PCR擴增微衛(wèi)星DNA（反應體系和程序同前），退火溫度范圍在55℃～60℃.擴增產物經5%聚丙烯酰胺凝膠電泳后，銀染、顯色，依據凝膠上的條帶判斷其是否具有多態(tài)性.2結果2.1中華按蚊微衛(wèi)星D

6、NA庫構建的中華按蚊微衛(wèi)星DNA庫中包含282條序列，其中18條序列完全相同，21條序列較短（小于100bp），故有效的微衛(wèi)星DNA序列共252條，GenBank注冊號為EF620047～EF620298.分析所獲的微衛(wèi)星DNA序列，顯示其長度范圍為50～800bp，大多數在300bp左右.就重復情形而言，雙核苷酸重復最為常見，三核苷酸重復次之，多核苷酸重復少見；含（CA）和（GT）重復的序列最多，重復次數不等，最多可達56次.所獲的微衛(wèi)星DNA依據文獻［8］標準劃分，結果完整序列為89條（35.3%），非完整序列51條（20.2%），復合序列47條（18.7%），其余為

7、非典型序列（25.8%）.2.2中華按蚊微衛(wèi)星多態(tài)位點設計并合成了22對擴增微衛(wèi)星DNA的引物，對現(xiàn)場樣本進行擴增的結果顯示，20個位點有特異的PCR產物，經聚丙烯酰胺凝膠電泳分析（一條帶為純合子，兩條帶以上為雜合子），共有15個微衛(wèi)星DNA位點具有多態(tài)性（表1）.本研究的多態(tài)微衛(wèi)星位點在退火溫度為55℃時，均存在特異產物.表1中華按蚊多態(tài)的15個微衛(wèi)星位點特征3討論通過比較分析本研究所獲中華按蚊微衛(wèi)星DNA序列的特點，發(fā)現(xiàn)與已報告的岡比亞按蚊（An.gambiae）［9-10］，催命按蚊（An.funestus）［11-12