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《人肺上皮細胞表達蛋白酶激活受體論文》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關內(nèi)容在工程資料-天天文庫。
1、人肺上皮細胞表達蛋白酶激活受體論文王海燕,何韶衡,付意玲,方澤曼【關鍵詞】蛋白酶激活受體Expressionofproteaseactivatedreceptorsonhumanlungepithelialcells【Abstract】AIM:Toexploretheexpressionofproteaseactivatedreceptors(PARs)onlungepithelialcells.METHODS:EM培養(yǎng)液、胎牛血清（FBS）購自Gibco公司，TRIZOLReagent購自Invitrogen公司,TAKARALARTPCRkit,購自TAKARA公
2、司，SYBRGreenI核酸凝膠染料購自BMA公司,.freelAb,兔抗人PAR3和兔抗人PAR4多克隆抗體及相應的同型對照均購自SantaCruz公司.FITC標記的羊抗兔IgG二抗購自BDPharmingen公司.PCR儀PTC200購自MJResearch公司，激光掃描共聚焦顯微鏡系統(tǒng)購自日本Nikon公司，F(xiàn)ACSCalibur流式細胞儀購自BectonDickinson公司.1.2方法1.2.1細胞培養(yǎng)人肺癌上皮細胞系A549細胞接種于50mL培養(yǎng)瓶內(nèi)，用DMEM完全培養(yǎng)液（含100g/LFBS，1×105u/L青霉素和100mg/L鏈霉素），于37℃,5
3、0mL/LCO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng).1.2.2RTPCR收集培養(yǎng)的A549細胞，用TRIZOLReagent提取細胞總RNA，具體操作步驟按試劑說明進行.RNA經(jīng)10g/L瓊脂糖電泳后，按TAKARARTPCRkit說明進行cDNA合成.逆轉(zhuǎn)錄的條件為：oligod(T),42℃30min，99℃5min,5℃5min.PAR1，PAR2，PAR3，PAR4和βactin的特異性引物均由上海博亞生物技術有限公司合成.βactin（F）5′AGGGGCCGGACTCGTCATACT3′,（R）5′GGCGGCAACACCATGTACCCT3′，PAR1（F）5′CAGCTCC
4、TGGCTGACACTCTTTGTC3′，（R）5′CGAGCAGGGTTTCATTGAGCACAT3′,PAR2（F）5′GCAGCCTCTCTCTCCTGCAGTGG3′，（R）5′CTGAGGCAGGTCATGAAGAGAATGG3′，PAR3（F）5′GGCTGGACAGGAGCCACGAT3′，（R）5′AGCGGTTGATGCTGATGCAGG3′,PAR4（F）5′GGATCGCCTACCACCTGCGTG3′，（R）5′CCCGTAGCACAGCAGCATGG3′.βactin的PCR擴增條件為：94℃2min,94℃30s,55℃30s,72℃30s
5、,35個循環(huán),72℃10min.PAR1,PAR2,PAR3和PAR4的PCR擴增條件為：94℃2min,94℃30s,67℃30s,72℃1min,35個循環(huán),72℃10min.PAR1,PAR2,PAR3和PAR4擴增的目的片段分別為500,461,403和401bp；βactin的擴增片段為202bp.PCR擴增片段經(jīng)測序驗證.1.2.3流式細胞術分析待培養(yǎng)細胞生長至70%~80%時，用非酶性細胞分離液懸浮細胞，10g/LBSA/PBS洗2次，調(diào)整細胞密度為5×109~1×1010/mL，40g/L多聚甲醛室溫固定10min,按說明書分別加入1∶20PE標記的抗
6、PAR1、抗PAR2小鼠抗人mAb、1∶20抗PAR3、抗PAR4兔多克隆抗體及相應的同型對照抗體，4℃避光孵育30min,10g/LBSA/PBS洗2次;PAR3,PAR4管再加入FITC標記的羊抗兔Ig二抗，4℃避光孵育30min,10g/LBSA/PBS洗2次,最后各管均加入500μL1×PBS懸浮細胞，使用流式細胞儀CELLQUEST軟件檢測和分析上皮細胞PAR的表達情況.1.2.4免疫熒光細胞染色將A549細胞接種于8孔顯微鏡玻片培養(yǎng)過夜，用10g/LBSA/PBS漂洗后加入甲醇固定20min,然后用10g/LBSA/PBS孵育5min，加入1∶20的PE標
7、記的抗PAR1、抗PAR2小鼠抗人mAb、抗PAR3、抗PAR4兔多克隆抗體及相應的同型對照抗體，室溫避光孵育1h,10g/LBSA/PBS洗3次,PAR3，PAR4管再加入FITC標記的羊抗兔Ig二抗，室溫避光孵育1h,10g/LBSA/PBS洗3次,最后用甘油封片，共聚焦顯微鏡下觀察.2結(jié)果2.1肺上皮細胞PARsmRNA的表達肺上皮細胞表達PAR1，PAR2，PAR3和PAR4的mRNA，擴增PAR1，PAR2，PAR3和PAR4mRNA的長度分別為500,461,403和401bp（Fig1）.2.2肺上皮細胞PARs蛋白質(zhì)的表達流式細胞儀檢
