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1、細(xì)菌dna提取方案細(xì)菌DNA提取方案細(xì)菌DNA提取方案：革蘭氏陰性菌，如E.coli，一般有三種可以選擇的方法。一、水煮模板法——主要用于PCR反應(yīng)1、接種單菌落于LB或腦心平板，連續(xù)畫線，37攝氏度培養(yǎng)18－24小時(shí)。2、刮取1～2接種環(huán)菌苔加入150微升三蒸水中，混勻，100攝氏度煮沸10分鐘。3、12000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，取上清，－20攝氏度保存?zhèn)溆?。操作最簡便，?duì)試劑條件要求低。缺點(diǎn)是純度不夠高，可能會(huì)含有RNA、蛋白等雜質(zhì)。但是作為一般檢測目的的PCR反應(yīng)模板已經(jīng)足夠了。有人稱擴(kuò)增4kb以下片段都可用此種
2、方法制取模版，編者用此類模板PCR可以擴(kuò)增到3500bp的片段。編者建議：此法得到的模版保存時(shí)間短，強(qiáng)烈建議每月重新制作一次。二、CTAB/NaCl法1、接種一單菌落于5mlLB中,30℃培養(yǎng)過夜,2、取1ml種子培養(yǎng)液接入100ml2%LB中,37℃、220r/min培養(yǎng)16小時(shí);3、5000r/min離心10分鐘,棄去上清。4、加入10mlTE離心洗滌后,用10mlTE溶解菌體,混勻,-20℃保存?zhèn)溆谩?、取3.5ml菌懸液,加入184μl10%SDS,混勻,加入37μl10mg/ml蛋白酶K,混勻,37℃溫育1小時(shí)
3、6、加入740μl5mol/LNaCl,再加入512μlCTAB/NaCl,混勻,65℃溫育10分鐘。7、加入等體積的氯仿/異戊醇,混勻,10000r/min離心5分鐘,保留上清。8、上清中加入等體積的酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1),混勻,10000r/min離心5分鐘,保留上清。9、加入0.6倍的異丙醇,混勻,10000r/min離心5分鐘,收集DNA沉淀,用70%乙醇離心洗滌DNA沉淀。10、用1mlTE溶解DNA,加入終濃度為20μg/mlRNaseA,4℃保存。CTAB/NaCl法提取的DNA純度較高，蛋白雜
4、質(zhì)較少，保存時(shí)間長，編者更喜歡把終濃度為20μg/mlRnaseA加在第5步溫育的時(shí)候，這樣最后沒有RnaseA污染。每一步操作細(xì)致一些，得到的DNA可用于Southernblot。編者建議：長時(shí)間保存DNA可放于-20℃，但要盡量減少反復(fù)凍融，否則影響DNA質(zhì)量。第3頁共3頁細(xì)菌dna提取方案三、鹽析法1、1.5ml對(duì)數(shù)期菌液2、12000rpm30s3、200ul裂解液（同CTAB/NaCl法），37c,1hr4、66ul5MNaCL,混勻充分，12000rpm10min5、上清用粗槍頭取至新管6、等體積酚充分混勻，
5、12000rpm3min，反復(fù)抽提至無蛋白層7、取水層，等體積氯仿混勻，12000rpm3min8、上清至新管，2倍體積預(yù)冷無水乙醇9、-20C，20min，14000rpm，15min10、400ul70%冷乙醇洗滌11、干燥，100ul20ug/mlRNaseA，37C，30min12、2倍體積無水乙醇沉淀，70%冷乙醇洗滌13、干燥，溶于100ulTE介于方法一和方法二之間，CTAB雖然取出糖分效果較好，但CTAB本身也是有毒的，所以此方法放棄了CTAB。革蘭氏陽性菌，由于細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)與陰性菌有差別，裂解比陰性菌稍
6、微麻煩一些，可以采取CTAB/NaCl法稍加修改，在第四步加入終濃度2mg/ml的溶菌酶，37度溫育1h。實(shí)驗(yàn)注意：提基因組最好要將槍頭尖剪掉（剪掉以后在酒精燈上迅速過一下，使其斷口圓滑）。以免槍頭損傷基因組！抽干時(shí)最好是風(fēng)干！細(xì)菌基因組DNA的提取方法綜述，提供了5種方法。1快速微量提取法A.取1.5ml菌體培養(yǎng)物于一滅菌Ep管中，12000rpm離心1min,丟去上清夜，收集菌體。B.加入400ul裂解液（40mMTris-醋酸，20mM醋酸鈉,1mMEDTA,1%SDS,pH7.8）混勻,置于37oC水浴1hr。C
7、.然后加入200ul5mol/L的氯化鈉溶液，混勻后于13000rpm離心15min。D.取上清液，用苯酚抽提2次，氯仿抽提1次。E.加兩倍體積無水乙醇，1/10體積醋酸鉀(3M,pH8.0)，-20度保存1小時(shí)后，13000rpm離心15min，棄上清液，沉淀用70%乙醇洗2次；置于室溫干燥后，溶于50ulTE溶液中，置4℃保存?zhèn)溆谩?蛋白酶/SDS法制備第3頁共3頁細(xì)菌dna提取方案先用10ml含適當(dāng)抗生素的GBM過夜培養(yǎng)Delftiasp.，第二天4000rpm離心10min收集菌體，用WashingTE（50mm
8、ol/LTris-HClpH8.0,10mmol/LEDTApH8.0）洗菌體2次，之后將菌體充分懸浮在5ml1×TE緩沖液中，先后加入0.5ml5mg/L的蛋白酶、0.5ml10%SDS，輕輕混勻后50℃放置3h~5h，接著用等體積的Tris飽和苯酚抽提2次，苯酚/氯仿/異戊醇抽提一次，氯仿抽提一次后，乙醇沉淀DN
