增齡對(duì)大鼠海馬nshc蛋白的影響論文

《增齡對(duì)大鼠海馬nshc蛋白的影響論文》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫(kù)。

1、增齡對(duì)大鼠海馬NShc蛋白的影響論文胡長(zhǎng)春葉露夢(mèng)朱婉兒【摘要】目的研究不同月齡大鼠海馬NShc蛋白的表達(dá)，以及經(jīng)氧化應(yīng)激后NShc磷酸化水平的改變隨年齡的增加而變化的規(guī)律。方法采用蛋白免疫印跡的方法，分別分析幼年組、成年組和老年組大鼠海馬NShc蛋白的表達(dá)水平，以及經(jīng)H2O2刺激后NShc磷酸化水平的改變。結(jié)果幼年組、成年組、老年組海馬NShc蛋白的含量依次減少（P＜0.05），但成年組和老年組之間沒(méi)有顯著性差異；H2O2處理后，幼年組、成年組、老年組海馬NShc蛋白磷酸化水平也依次減少（P＜0.01），而成年組和老年組之間無(wú)顯

2、著差異。結(jié)論隨著年齡的增加，海馬中NShc蛋白的表達(dá)逐漸減少并且NShc蛋白的活性逐漸降低。【關(guān)鍵詞】增齡；NShc；海馬；氧化應(yīng)激增齡作為細(xì)胞的應(yīng)激刺激.freela公司。1.3方法1.3.1蛋白提取和定量大鼠在麻醉后斷頭，并在冰上分離出海馬、嗅球、額皮質(zhì)、后皮質(zhì)、丘腦、下丘腦、小腦、脊髓、心臟、肝臟、肌肉組織。在冰浴中將組織標(biāo)本置于1ml裂解液中超聲處理30s，14000r/min離心30s，取上清夜到0.5ml離心管中，于-20℃保存。然后采用Bradford比色法進(jìn)行蛋白定量。1.3.2H2O2處理的海馬組織分離和切片制作大鼠在

3、無(wú)麻醉狀態(tài)下斷頭，在冰上分離出海馬，隨后用McIl的切片；37℃條件下，切片在含氧的KR緩沖液中培養(yǎng)1h，恢復(fù)生理活性；每一月齡組的每只大鼠海馬切片分為4組：對(duì)照組只是培養(yǎng)在KR緩沖液中，其余3組分別在含有1mmol/LH2O2的KR緩沖液中處理5、15和30min。1.3.3免疫沉降取含有500μg蛋白的大鼠海馬組織蛋白上清液，在冰上加適量羊多克隆NShc抗體反應(yīng)1h，隨后與G蛋白瓊脂混合，放在振動(dòng)平臺(tái)上反應(yīng)一個(gè)晚上；次日以14000r/min離心30s，棄去上清夜，沉淀物用PBS清洗兩次，加入50μl1/3SDS2巰基乙醇上樣緩沖液

4、，于沸水中加熱5min，然后放入冰中冷卻5min后，取14000r/min離心，取上清夜作為電泳樣品進(jìn)行免疫印跡分析。1.3.4免疫印跡分析依照標(biāo)準(zhǔn)方法提取的蛋白，進(jìn)行SDSPAGE電泳；然后將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，用封閉液A（含5％脫脂奶粉的TTBS緩沖液，針對(duì)非磷酸化抗體）或封閉液B（含5％BAS的TBST緩沖液，針對(duì)磷酸化抗體）封閉1h；按推薦濃度的第一抗體（鼠抗NShc抗體、鼠抗Sck抗體、鼠抗Shc抗體或抗pTyr抗體）室溫下反應(yīng)2h，用TTBS200ml清洗3次；按推薦二抗(抗鼠IgGHRP)的濃度室溫孵育1h，

5、然后同上清洗；最后加入發(fā)光底物后X光膠片感光30min，經(jīng)顯影定影顯現(xiàn)信號(hào)。1.3.5圖象分析X光膠片經(jīng)GS800Calibrated圖像光密度儀分析，測(cè)定目標(biāo)帶單位密度，并以正常對(duì)照的單位密度值為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行校正，定量分析磷酸化NShc蛋白和總NShc蛋白水平。磷酸化NShc蛋白量和總NShc蛋白量相除可得各個(gè)樣本的磷酸化程度，所得數(shù)據(jù)除以相應(yīng)月齡對(duì)照組（H2O2刺激0min）的平均值作為NShc磷酸化含量。1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析數(shù)據(jù)以x±s表示，SPSS13.0軟件統(tǒng)計(jì)進(jìn)行單因素方差分析，進(jìn)一步的兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)。2結(jié)果2.1Shc

6、家族蛋白在大鼠神經(jīng)系統(tǒng)及其他系統(tǒng)組織的表達(dá)大鼠NShc蛋白（包括p52NShc和p64NShc）和Sck蛋白的表達(dá)集中在神經(jīng)系統(tǒng)各組織（包括嗅球、額皮質(zhì)、后皮質(zhì)、海馬、丘腦、下丘腦、小腦和脊髓），在心臟、肝臟和肌肉組織中幾乎沒(méi)有表達(dá)；而Shc蛋白主要在心臟和肝臟中表達(dá)，見(jiàn)圖1。2.2NShc蛋白在不同月齡大鼠海馬中的表達(dá)erkerK,etal.Decreasedproteolysiscausedbyproteinaggregates，inclusionbodies，plaques，lipofuscin，ceroid，and′aggre

7、somes′duringoxidativestress，aging，anddisease〔J〕.IntJBiochemCellBiol，2004；36(12)：251930.2BruceR，TroenMD.Thebiologyofaging〔J〕.MtSinaiJMed，2003；70(1)：321.3NakamuraT，KomiyaM，GotohN,etal.DiscriminationbetediatedsignalingpropertiesofconventionalandneuronalShcadaptermolecules〔J〕

8、.Oncogene，2002；21(1):2231.4TroglioF，EchartC，GobbiA,etal.TheRai(ShcC)adaptorprotei