hhgf基因腎臟電轉(zhuǎn)染對大鼠腎缺血再灌注損傷的保護(hù)作用論文

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1、hHGF基因腎臟電轉(zhuǎn)染對大鼠腎缺血再灌注損傷的保護(hù)作用論文李宓杜藝陳家湄彭莉鄒和群【摘要】目的:使用腎臟直接基因電轉(zhuǎn)染方法對大鼠腎臟進(jìn)行hHGF基因轉(zhuǎn)染，觀察該基因轉(zhuǎn)染對腎臟缺血再灌注損傷的保護(hù)作用.方法:雄性SD大鼠20只，隨機(jī)分為轉(zhuǎn)染組和對照組，每組10只.在熱缺血前3d將含有hHGF基因的質(zhì)粒用電轉(zhuǎn)染方法轉(zhuǎn)入大鼠腎臟，3d后建立大鼠腎熱缺血模型，觀察hHGF的藥代動力學(xué)，并對缺血腎臟進(jìn)行功能和組織學(xué)評價(jià).結(jié)果:hHGF基因電轉(zhuǎn)染組腎組織及血漿hHGF基因表達(dá)水平高于對照組(P0.01).轉(zhuǎn)染組血肌酐水平低于對照組(P0.01),腎功能恢復(fù)快于對照組.組織學(xué)評價(jià)顯示，轉(zhuǎn)

2、染組腎小管細(xì)胞凋亡評分低于對照組(P0.05).轉(zhuǎn)染組淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及中性粒細(xì)胞浸潤均較對照組少.結(jié)論:腎臟hHGF基因電轉(zhuǎn)染組hHGF藥代動力學(xué)和治療效果均顯示.freelAb（OxfordUK），ELISAhHGF檢測試劑盒（Quantikin）,CD45RC(OxfordUK),馬抗羊IgG（美國VectorLaboratories）,DAB顯色劑（SigmaAldrich），PARP凋亡過氧化酶試劑盒（西班牙LabclinicsBarcelona）,分光光度計(jì)（Beckman）,BTXECM830電轉(zhuǎn)染機(jī)(HarvardApparatus).1.2方法1.2.

3、1分組隨機(jī)分為2組，A組：熱缺血45min+非治療組（n=10）；B組：熱缺血45min+腎臟電轉(zhuǎn)染組(n=10).1.2.2引物設(shè)計(jì)用Primer分析軟件設(shè)計(jì)1對引物，上游引物為5′ACGGAATTCATGCCAGCACTGAAGATA3′；下游引物為5′ACGGGATCCTCATTATCGCAGTTGTTTCG3′；引物由大連寶生物工程有限公司合成.以pRC/CMVhHGF為模板進(jìn)行擴(kuò)增，全長為1340bp.cDNAPCR反應(yīng)體系：50μL，引物0.8μg，模板0.1μg，常規(guī)量dNTPs，Mg2+及Taq酶，反應(yīng)體系95℃1min，40℃50s，70℃2mi

4、n,循環(huán)5次，95℃1min，60℃50s，72℃2min，循環(huán)25次，72℃延伸5min.PCR產(chǎn)物經(jīng)10g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，用EcoRI和BamHI消化后與載體pBSks連接.產(chǎn)物用CaCl2法轉(zhuǎn)化E.coliJMI09，以堿裂解法提取質(zhì)粒，質(zhì)粒DNA結(jié)合SP1017，結(jié)合后的基因治療效果較裸體DNA電轉(zhuǎn)染的治療效果為佳，將質(zhì)粒DNA溶解于的TE緩沖液中（濃度為4g/L），等量的質(zhì)粒DNA和2g/LSP10170混合制成2g/L的DNA及0.1g/L的SP1017混和液備用.1.2.3hHGF基因腎臟電轉(zhuǎn)染手術(shù)暴露腎和腎蒂，在接近腹主動脈處用血管鉗夾閉雙腎動脈以

5、防注入的液體流出，但腎動脈夾閉時間不能超過12min以避免嚴(yán)重的缺血損傷，立即由雙腎動脈注入400μL含有hHGF質(zhì)粒的混懸液及100U胰島素，用電極片夾起腎臟，并給以電脈沖，頻率為1HZ，每次6個50ms的電脈沖，電壓為100V［3］.于電轉(zhuǎn)染3d之后，在37℃環(huán)境中，麻醉后切開腹腔，暴露左腎，夾閉腎A和腎V45min，然后打開.常溫下室內(nèi)飼養(yǎng)1in離心，取上清試管加蓋后4℃冰箱保存，ELISA法檢測hHGF.1.2.4組織學(xué)評價(jià)及組織hHGF基因表達(dá)在缺血后8d取大鼠左腎制成組織石蠟包埋塊，并將包埋塊切片（3～4μm），脫蠟后分別用蘇木素署紅及PAS染色.根據(jù)腎小管壞

6、死和再生情況，從病理學(xué)角度將其分為0~3分.0分：正常組織；1分：少于1/3的組織受損；2分：1/3~2/3的組織受損；3分：所有組織受損.腎小管受損的評估標(biāo)準(zhǔn)為：細(xì)胞腫脹、凋亡，細(xì)胞支持消失，刷狀緣破壞.腎小管修復(fù)的標(biāo)準(zhǔn)：出現(xiàn)細(xì)胞核的有絲分裂.腎組織hHGF基因表達(dá)檢測采用免疫組化法，見文獻(xiàn)［4］.1.2.5巨噬細(xì)胞及淋巴細(xì)胞的免疫組化1抗使用1∶100稀釋的鼠抗鼠mAb，作用于巨噬細(xì)胞的ED1，1∶200稀釋的鼠抗鼠mAb及1∶25稀釋的羊抗人多克隆HGF抗體作用于T和B淋巴細(xì)胞蛋白CD45RC.使用1∶200稀釋的馬抗鼠IgG作為二抗和1∶200稀釋的馬抗羊IgG，

7、顯色劑使用DAB顯色［4］.1.2.6組織過氧化物氧化評價(jià)大鼠腎組織中性粒細(xì)胞浸潤通過白細(xì)胞MPO方法進(jìn)行評估.將組織中加入pH6.050mol/L的kd緩沖液中（含5g/L的溴化十六碳烷基三胺）快速液氮冷凍，然后30s解凍，重復(fù)3次，60℃孵育2h,離心后取上清檢測MPO，MPO用偶氮藍(lán)和5mg/L的氫氧化物顯色，用460nm的分光光度計(jì)檢測MPO濃度.采用PARP凋亡過氧化酶試劑盒進(jìn)行檢測.腎臟內(nèi)ED1,.freeleffectsofacuteischemiaandreperfusioninjury［J］.K