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《談產(chǎn)有機磷農(nóng)藥降解酶菌株的篩選及酶學(xué)性質(zhì)研究》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、談產(chǎn)有機磷農(nóng)藥降解酶菌株的篩選及酶學(xué)性質(zhì)研究摘 要 通過用乙酰膽堿酯酶抑制法檢測有機磷農(nóng)藥，從土壤中分離篩選出能降解敵敵畏的7個菌株，從其中降解能力較強的菌株OPD7提取胞內(nèi)酶，并進行酶學(xué)性質(zhì)的研究。結(jié)果表明，該酶分解敵敵畏的最適pH為7.0，最適溫度為42℃，pH穩(wěn)定范圍為6-8，在低于47℃時穩(wěn)定；該酶也能降解乙酰甲胺磷、甲胺磷、樂果和氧化樂果。關(guān)鍵詞 敵敵畏 有機磷農(nóng)藥降解酶酶學(xué)性質(zhì) 談產(chǎn)有機磷農(nóng)藥降解酶菌株的篩選及酶學(xué)性質(zhì)研究摘 要 通過用乙酰膽堿酯酶抑制法檢測有機磷農(nóng)藥，從土壤中分離篩選
2、出能降解敵敵畏的7個菌株，從其中降解能力較強的菌株OPD7提取胞內(nèi)酶，并進行酶學(xué)性質(zhì)的研究。結(jié)果表明，該酶分解敵敵畏的最適pH為7.0，最適溫度為42℃，pH穩(wěn)定范圍為6-8，在低于47℃時穩(wěn)定；該酶也能降解乙酰甲胺磷、甲胺磷、樂果和氧化樂果。關(guān)鍵詞 敵敵畏 有機磷農(nóng)藥降解酶酶學(xué)性質(zhì)有機磷農(nóng)藥(Organophosphates，簡稱OPS)具有殺蟲效率高、防治范圍廣、成本低等特點，在保護農(nóng)作物免受病蟲草害侵染、提高糧食產(chǎn)量等方面發(fā)揮了巨大作用，大大促進了農(nóng)業(yè)生產(chǎn)[1]，但同時它們也對人類賴以生存的環(huán)
3、境造成了嚴重的污染，而且經(jīng)常導(dǎo)致蔬菜和水果等農(nóng)產(chǎn)品農(nóng)藥殘留超標，直接危害人們的身體健康[2]。因此，當前迫切需要建立一種用于治理環(huán)境污染、去除農(nóng)產(chǎn)品的農(nóng)藥殘留的有效方法。目前最有潛力的有效方法之一是生物技術(shù)的方法：利用能夠降解農(nóng)藥的微生物來治理受農(nóng)藥污染的環(huán)境，利用農(nóng)藥降解酶來清除表面農(nóng)藥殘留超標的農(nóng)產(chǎn)品[3]，其前提是培育出能高效降解農(nóng)藥的菌株和制備出高效的農(nóng)藥降解酶。為了實現(xiàn)用生物學(xué)方法來解決農(nóng)藥殘留危害的目標，建立一種快速、簡便、成本低的篩選農(nóng)藥降解菌并從中提取降解酶的方法，是當前生物學(xué)家首先
4、要解決的重要任務(wù)。本文旨在探索一種分離篩選能高效降解有機磷農(nóng)藥的微生物的簡單、快捷的方法，同時對有機磷降解酶進行初步研究，為解決農(nóng)藥殘留所造成的危害問題提供生物學(xué)基礎(chǔ)。1．材料與方法1.1土壤的土壤取自農(nóng)藥廠的排污水溝和附近的農(nóng)田。1.2乙酰膽堿酯酶從家蠅頭部提取。1.3培養(yǎng)基富集培養(yǎng)基()：NaNO32，KCl0.5,CaCl20.05，KH2PO41，MgSO4.7H2O0.5，pH7.0,使用前加入適量敵敵畏濃縮液。分離培養(yǎng)基()：KH2PO40.5，(NH4)SO40.5，F(xiàn)eSO4O.00
5、1g，K2HPO40.2，CaC120.005,MgSO4.7H2O0.2，使用前加入適量敵敵畏濃縮液。發(fā)酵培養(yǎng)基()：蛋白胨1.0，酵母粉0.5，NaCl1.0，pH7.0。1.4 菌株的富集、馴化和篩選取2g土樣于100m1富集培養(yǎng)基中，加敵敵畏至100mg/L，37℃振蕩培養(yǎng)24h，所得菌液接入新的富集培養(yǎng)基中（接種量10），并提高敵敵畏濃度到200mg/L，24h后接入新的富集培養(yǎng)基中，敵敵畏終濃度提高至300mg/L，如此循環(huán)至培養(yǎng)液中敵敵畏濃度達到500mg/L。然后，將培養(yǎng)液接入分離培
6、養(yǎng)基（敵敵畏濃度為500mg/L）繼續(xù)培養(yǎng)，一周后再移種一次。將富集所得菌液適當稀釋，涂布于分離平板，觀察是否有菌落生長，選擇生長旺盛的菌落進行純化。1.5敵敵畏降解酶粗酶液的提取用發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)菌體，離心收集菌體，用0.02mol/L,pH7.0的磷酸緩沖液洗滌后再離心，用適量磷酸緩沖液懸浮所得菌體，用JY92-II型超聲波細胞粉碎機破碎細胞（工作電壓220V，工作時間10S，間隔時間15S，120個循環(huán)），離心所得上清液即粗酶液。1.6乙酰膽堿酯酶活性測定乙酰膽堿酯酶能分解靛酚乙酸酯(紅色)為靛
7、酚(藍色)和乙酸，靛酚的吸收峰在605nm，所以可以通過吸光度變化值來測定酶活力。在試管中加入10μl乙酰膽堿酯酶，470μl0.02mol/L，pH7.0磷酸緩沖液，20μl2靛酚乙酸酯，混勻，37℃水浴中反應(yīng)5分鐘，加入500μl95％乙醇終止反應(yīng)，測OD605，計算酶活力。1.7乙酰膽堿酯酶抑制法檢測農(nóng)藥殘留在試管中加入470μl不同濃度的有機磷農(nóng)藥（對照管加dH2O）,10μl乙酰膽堿酯酶，混勻，于37℃水浴中反應(yīng)10分鐘，加入20μl靛酚乙酸酯，混勻，37℃反應(yīng)5分鐘，加入500μl95％
8、乙醇終止反應(yīng)，測OD605。計算酶的抑制率，以農(nóng)藥濃度的對數(shù)為橫坐標、抑制率為縱坐標作出標準曲線。抑制率的計算公式為:I=(Uo一UI)/Uo×100其中Uo：未受抑制的酶活力，UI：受農(nóng)藥抑制的酶活力。1.8有機磷農(nóng)藥降解酶酶活力的測定取470μl粗酶液，加敵敵畏至1000mg/L，37℃反應(yīng)30分鐘，沸水中加熱5分鐘終止反應(yīng)，然后用酶抑制法測定農(nóng)藥殘留。酶活力單位定義：在37℃，pH7.0的條件下，每分鐘分解0.1µg敵敵畏所需的酶量為一個酶活單位(U
