低氧誘導(dǎo)因子過(guò)表達(dá)對(duì)人外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞分化影響的體外研究

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1、低氧誘導(dǎo)因子過(guò)表達(dá)對(duì)人外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞分化影響的體外研究作者：姜萌，王長(zhǎng)謙，王彬堯，何奔，邵琴，黃定九【摘要】為了研究低氧誘導(dǎo)因子(hypoxiainduciblefactor-1alpha，HIF-1α)在體外對(duì)人外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelialprogenitorcells，EPC)向血管內(nèi)皮細(xì)胞(endothelialcells，EC)分化的影響，用密度梯度離心法分離人外周血EPC，電穿孔技術(shù)轉(zhuǎn)染HIF-1α質(zhì)粒至EPC，計(jì)算轉(zhuǎn)染效率，RT-PCR方法測(cè)定HIF-1α、HIF-1β及HIF-1α下游靶基因血

2、管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascularendothelialgroRNA在質(zhì)粒轉(zhuǎn)染前后含量變化，免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)在常氧下HIF-1α蛋白在HIF-1α質(zhì)粒轉(zhuǎn)染前后不同時(shí)點(diǎn)蛋白表達(dá)情況，細(xì)胞膜表面抗原決定簇流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定FITC-CD31+EPCs/EC在未轉(zhuǎn)染組、pEGFP空質(zhì)粒或HIF-1α質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組轉(zhuǎn)染3-10天后的組間差異，光鏡下觀察轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞形態(tài)及分化程度。結(jié)果表明：EPC獲得后經(jīng)電穿孔轉(zhuǎn)染，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率約20%；RT-PCR示HIF-1αmRNA在常氧中有表達(dá)，并在HIF-1α過(guò)表達(dá)組含量增加（P<0.0

3、5）；其下游靶基因VEGF在HIF-1α過(guò)表達(dá)組表達(dá)上調(diào)（P<0.05）；HIF-1β表達(dá)在各組中無(wú)明顯差異（P>0.05）。免疫組織化學(xué)顯示常氧下HIF-1α蛋白無(wú)表達(dá)，轉(zhuǎn)染HIF-1α質(zhì)粒12小時(shí)后HIF-1α蛋白表達(dá)陽(yáng)性，轉(zhuǎn)染24小時(shí)后蛋白表達(dá)陰性。流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示電穿孔轉(zhuǎn)染HIF-1α質(zhì)粒使CD31+細(xì)胞的百分比增加（P<0.05）。細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察顯示：未轉(zhuǎn)染及pEGFP空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細(xì)胞在培養(yǎng)6天后呈集落樣散在分布，培養(yǎng)14天后貼壁細(xì)胞部分呈梭樣；穿孔轉(zhuǎn)染的HIF-1α質(zhì)粒組細(xì)胞于培養(yǎng)6天后集

4、落周邊分化出梭樣貼壁細(xì)胞，培養(yǎng)14天后呈梭樣，或鋪路石樣牢固貼壁。結(jié)論：HIF-1α質(zhì)粒能有效地用于基因干擾治療，有助于EPC向EC分化，為體內(nèi)研究奠定了基礎(chǔ)，也為進(jìn)一步體內(nèi)誘導(dǎo)血管新生、治療缺血性心臟病提供了更廣闊的治療選擇?！娟P(guān)鍵詞】低氧誘導(dǎo)因子-1α　　OverexpressionofHypoxiaInducibleFactor-1alpha(HIF-1α)PromotestheDifferentiationofEndothelialProgenitorCellExVivo　　AbstractToinvestiga

5、tetheinfluenceofHIF-1αoverexpressiononthedifferentiationofendothelialprogenitorcells(EPCs)exvivo，EPCshumanperipheralbloodbydensitygradientcentrifugation，overexpressedHIF-1αRNAleveleasuredmunohistochemistryinatimecourse.CD31+cellseasuredetry.Cellmorphologyarkedlyi

6、nducedbyHIF-1αvector(P<0.05).HIF1βhaditssamelevelasitbeforeinterference(P>0.05).HIF-1αprotEInentsrevealedthatCD31+EPCs/ECcouldbegeneratedmoreefficientlyfromoverexpressedHIF-1αthanthatfrompEGFPtransfectedgroup(P>0.05).EPCmorphologyicroscopy.HIF-1α-transfe

7、ctedcellsundernormoxiasproutedmorerapidlyfromtheEPCcoloniesthantheuntransfectedcellsorcellstransfectedaintainedtheoriginalcolonyformation.HIF-1αtransfectedcellstookonanarray-likearrangementratherthanrandomdispersal，suggestingthattheyictreatemtninvivo.　　KeyershamB

8、ioscience公司；60mm細(xì)胞培養(yǎng)皿（Falcon公司產(chǎn)品)；M199培養(yǎng)基(Gibco公司產(chǎn)品)；VEGF生長(zhǎng)因子終濃度10ng/ml、bFGF生長(zhǎng)因子終濃度2ng/ml(CytoLab/PeprotechAsia產(chǎn)品)，0.22μm微孔濾膜抽濾后，-20℃保存?zhèn)溆茫?0%胎牛血清(鼎國(guó)生物公司產(chǎn)品)；人外周