外源基因在大腸桿菌中的表達(dá)

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1、重組DNA技術(shù)與基因工程523416重組DNA技術(shù)與基因工程的基本概念重組DNA技術(shù)所需的基本條件重組DNA技術(shù)的操作過程目的基因的克隆與基因文庫的構(gòu)建外源基因在大腸桿菌中的表達(dá)外源基因在酵母中的表達(dá)A大腸桿菌作為表達(dá)外源基因受體菌的特征5外源基因在大腸桿菌中的表達(dá)大腸桿菌表達(dá)外源基因的優(yōu)勢全基因組測序，共有4405個開放型閱讀框架基因克隆表達(dá)系統(tǒng)成熟完善繁殖迅速、培養(yǎng)簡單、操作方便、遺傳穩(wěn)定被美國FDA批準(zhǔn)為安全的基因工程受體生物A大腸桿菌作為表達(dá)外源基因受體菌的特征5外源基因在大腸桿菌中的表達(dá)大腸桿菌

2、表達(dá)外源基因的劣勢缺乏對真核生物蛋白質(zhì)的復(fù)性功能缺乏對真核生物蛋白質(zhì)的修飾加工系統(tǒng)內(nèi)源性蛋白酶降解空間構(gòu)象不正確的異源蛋白細(xì)胞周質(zhì)內(nèi)含有種類繁多的內(nèi)毒素B外源基因在大腸桿菌中高效表達(dá)的原理5外源基因在大腸桿菌中的表達(dá)啟動子終止子核糖體結(jié)合位點密碼子質(zhì)?？截悢?shù)啟動子啟動子最佳距離的探測目的基因EEAEE啟動子A酶切開Bal31酶解目的基因啟動子啟動子的篩選AprorigalKpKO1終止密碼子采用鳥槍法戰(zhàn)略，將合適大小的DNA片段克隆到啟動子探針質(zhì)粒pKO1上。受體細(xì)胞染色體DNA上的galE、galT與質(zhì)

3、粒上報告基因galk的表達(dá)產(chǎn)物聯(lián)合作用，可將培養(yǎng)基中的半乳糖酵解成紅色素物質(zhì)轉(zhuǎn)化galE+、galT+、galK-的大腸桿菌受體菌株含有外源啟動子活性的重組克隆啟動子啟動子的構(gòu)建-35區(qū)序列-10區(qū)序列PlLPrecAPtrpPlacPtraAPtac啟動子TTGACAGATACTTTGATATATAATTTGACATTAACTTAGACATAATGTTTTACATATAATTTGACATATAATPtac=3Ptrp=11Plac啟動子啟動子的可控性P乳糖啟動子Plac的可控性：OPO高效轉(zhuǎn)錄阻遏蛋白誘

4、導(dǎo)乳糖異丙基-b-D-硫代半乳糖苷（IPTG）野生型的Plac與其控制區(qū)Olac偶聯(lián)在一起，在沒有誘導(dǎo)物存在時，操縱子基底水平轉(zhuǎn)錄處于基底水平表達(dá)；誘導(dǎo)物可以使啟動子Plac介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄大幅提高。啟動子啟動子的可控性Plac乳糖啟動子Plac的可控性：OPlacO高效轉(zhuǎn)錄葡萄糖代謝野生型的Plac上游附近擁有代謝激活因子（CAP）結(jié)合區(qū)，小分子cAMP激活CAP，CAP結(jié)基底水平轉(zhuǎn)錄啟動子控制區(qū)，進(jìn)而促進(jìn)Plac介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄。葡萄糖代謝使cAMP減少，也能阻遏Plac介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄。因此，基因工程中使用的乳糖

5、啟動子均為抗葡萄糖代謝阻遏的突變型，即PlacUV5。CAPcAMPcAMP濃度降低PlacUV5O高效轉(zhuǎn)錄Ptrp色氨酸啟動子Ptrp的可控性：Otrp除去色氨酸色氨酸啟動子Ptrp受色氨酸-阻遏蛋白復(fù)合物的阻遏，轉(zhuǎn)錄呈基底狀態(tài)。在培養(yǎng)系統(tǒng)中去除色氨酸基底水平轉(zhuǎn)錄或者加入3-吲哚丙烯酸（IAA），便可有效地解除阻遏抑制作用。在正常的細(xì)菌培養(yǎng)體系中，除去色氨酸是困難的，因此基因工程中往往添加IAA誘導(dǎo)Ptrp介導(dǎo)的目基因的表達(dá)。色氨酸或加3-吲哚丙烯酸高效轉(zhuǎn)錄阻遏蛋白（IAA）OtrpPtrp高效轉(zhuǎn)錄Ot

6、rpPtrp啟動子啟動子的可控性l噬菌體啟動子PlL的可控性：噬菌體啟動子PL受CI阻遏蛋白阻遏，很難直接誘導(dǎo)控制。在基因工程中常使用溫度敏感型的cI突變基因cI857控制PL。cI857阻遏蛋白在42℃時失活脫落，PL便介導(dǎo)目的基因的表達(dá)。但在大型細(xì)菌培養(yǎng)罐中迅速升溫非常困難，因此常使用一個雙質(zhì)?？刂葡到y(tǒng)，用色氨酸間接控制目的基因表達(dá)PtrpABcI857PL目的基因阻遏作用PtrpABPL表達(dá)色氨酸啟動子啟動子的可控性終止子強(qiáng)化轉(zhuǎn)錄終止的必要性外源基因在強(qiáng)啟動子的控制下表達(dá)，容易發(fā)生轉(zhuǎn)錄過頭現(xiàn)象，即R

7、NA聚合酶滑過終止子結(jié)構(gòu)繼續(xù)轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒上鄰近的DNA序列，形成長短不一的mRNA混合物過長轉(zhuǎn)錄物的產(chǎn)生在很大程度上會影響外源基因的表達(dá)，其原因如下：轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物越長，RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄一分子mRNA所需的時間就相應(yīng)增加，外源基因本身的轉(zhuǎn)錄效率下降；如果外源基因下游緊接有載體上的其它重要基因或DNA功能區(qū)域，如選擇性標(biāo)記基因和復(fù)制子結(jié)構(gòu)等，則RNA聚合酶在此處的轉(zhuǎn)錄可能干擾質(zhì)粒的復(fù)制及其它生物功能，甚至導(dǎo)致重組質(zhì)粒的不穩(wěn)定性；過長的mRNA往往會產(chǎn)生大量無用的蛋白質(zhì)，增加工程菌無謂的能量消耗；更為嚴(yán)重的是，過長的轉(zhuǎn)

8、錄物往往不能形成理想的二級結(jié)構(gòu)，從而大大降低外源基因編碼產(chǎn)物的翻譯效率。終止子強(qiáng)終止子的選擇與使用目前外源基因表達(dá)質(zhì)粒中常用的終止子是來自大腸桿菌rRNA操縱子上的rrnT1T2以及T7噬菌體DNA上的Tf。對于一些終止作用較弱的終止子，通?？梢圆捎枚垠w終止子串聯(lián)的特殊結(jié)pCP1AproriTcr篩選Apr、Tcs的轉(zhuǎn)化子終止子也可以象啟動子那樣，通過特殊的探針質(zhì)粒從細(xì)菌或噬菌體基構(gòu)，以增強(qiáng)其轉(zhuǎn)錄終止作用?；蚪MDNA中克隆