嗅黏膜嗅鞘細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究概述

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1、嗅黏膜嗅鞘細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究概述【關(guān)鍵詞】嗅鞘細(xì)胞嗅鞘細(xì)胞(olfactoryensheathingcells,OECs)在功能上是介于施萬(wàn)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞之間的一種特殊的膠質(zhì)細(xì)胞,具有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)、抑制膠質(zhì)增生、瘢痕形成、成鞘作用等，為軸突生長(zhǎng)提供了適宜的微環(huán)境及較強(qiáng)的遷移的特性，使其成為促進(jìn)中樞神經(jīng)再生的理想候選細(xì)胞之一。嗅鞘細(xì)胞同膠質(zhì)細(xì)胞、施萬(wàn)細(xì)胞在表現(xiàn)型上有共同點(diǎn)，它們都能促進(jìn)軸突的再生，主要區(qū)別在于嗅鞘細(xì)胞不但存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，也存在于外周神經(jīng)中。嗅黏膜中的神經(jīng)元是唯一的生后才生長(zhǎng)并在成年時(shí)繼續(xù)分化的神經(jīng)元，壽為4～12周，隨著新細(xì)胞的

2、生長(zhǎng)，又建立了新的神經(jīng)支配關(guān)系。嗅鞘細(xì)胞存在于嗅神經(jīng)及嗅球的神經(jīng)層上，沿嗅神經(jīng)的全長(zhǎng)，從周?chē)窠?jīng)系統(tǒng)到中樞神經(jīng)分布。成年哺乳類(lèi)嗅黏膜中的嗅覺(jué)神經(jīng)元具有終生更新的特點(diǎn),由此說(shuō)明嗅黏膜中存在神經(jīng)干細(xì)胞。嗅黏膜由源于外胚層的嗅板及位于其底部的間充質(zhì)發(fā)育、分化而來(lái),由上皮和固有層組成。上皮內(nèi)的嗅細(xì)胞是初級(jí)嗅覺(jué)神經(jīng)元,成體嗅黏膜內(nèi)的嗅細(xì)胞終生處于不斷凋亡、更新之中,新生嗅細(xì)胞的軸突進(jìn)入固有層由嗅鞘細(xì)胞包繞形成嗅神經(jīng),經(jīng)篩孔進(jìn)入嗅球與僧帽細(xì)胞形成突觸,在軸突的生長(zhǎng)和突觸的重建過(guò)程中,嗅鞘細(xì)胞具有重要的誘導(dǎo)作用〔1～3〕?！　?嗅鞘細(xì)胞的研究現(xiàn)狀嗅鞘細(xì)胞從

3、被發(fā)現(xiàn)到體外培養(yǎng)成功,再到能夠用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究及應(yīng)用于臨床研究,經(jīng)歷了漫長(zhǎng)的時(shí)間。Devon和Doucete〔4〕于1992年首次證實(shí)嗅鞘細(xì)胞可在體外培養(yǎng)條件下形成髓鞘。嗅鞘細(xì)胞移植治療脊髓損傷是近10年發(fā)展起來(lái)的。Li等〔5〕報(bào)道嗅鞘細(xì)胞移植到受損的成年大鼠皮質(zhì)脊髓束可以促進(jìn)軸突再生,脊髓功能得以改善。2000年Bar〔6〕首次報(bào)道用術(shù)中切除的嗅球在體外培養(yǎng)并擴(kuò)增人類(lèi)嗅鞘細(xì)胞,并證明這些細(xì)胞生理功能良好,植入嚙齒動(dòng)物脫髓鞘區(qū)域能髓鞘化軸突,且無(wú)致瘤性。近年從嗅黏膜中提取、純化培養(yǎng)嗅鞘細(xì)胞，以其獨(dú)特優(yōu)勢(shì)和臨床應(yīng)用價(jià)值，越來(lái)越受到重視?！　?嗅

4、鞘細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)取材方法成年SD大鼠體重250～300g,腹腔麻醉后,消毒面部皮膚。經(jīng)一側(cè)鼻孔沿鼻腔向上至內(nèi)眥部剪開(kāi)皮膚及鼻骨,暴露鼻中隔黏膜,用虹膜槍和眼科剪分離、剪取鼻中隔后三分之一嗅黏膜?？梢?jiàn)鼻中隔最后上部的嗅區(qū),呈黃色與呼吸道黏膜有較明顯的區(qū)別。將此嗅區(qū)鼻中隔(嗅黏膜和骨質(zhì))完整取下,在顯微鏡下將兩側(cè)的嗅黏膜自骨片上完整刮下,立即放入冰的DMEM抗生素液中(青霉素和鏈霉素各100IU/L)。有學(xué)者從后鼻孔和直接開(kāi)顱進(jìn)入鼻中隔，分離嗅黏膜?！　?嗅黏膜細(xì)胞的體外培養(yǎng)嗅黏膜取出后用F12培養(yǎng)基漂洗3次去除血跡后移至0.25%胰酶中,用眼科剪充

5、分剪碎并用吸管吹打,制成嗅黏膜混合細(xì)胞懸液,用培養(yǎng)基終止消化,離心、清洗去除胰酶，用含10%胎牛血清的F12培養(yǎng)基將細(xì)胞濃度調(diào)至1×106/ml,接種于無(wú)包被的玻璃培養(yǎng)皿,置CO2培養(yǎng)箱內(nèi)(37℃,5%CO2)培養(yǎng)。每2～3天換液一次。當(dāng)將離體嗅黏膜制成細(xì)胞懸液后,細(xì)胞之間的平衡即被打破,接觸抑制及反饋調(diào)節(jié)機(jī)制亦被解除。細(xì)胞懸液中的神經(jīng)干細(xì)胞在其他細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子和細(xì)胞外基質(zhì)的作用下,將進(jìn)入細(xì)胞分裂、增殖周期。整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程,更換培養(yǎng)液也十分關(guān)鍵。嗅黏膜OECs貼壁生長(zhǎng)時(shí)間較晚,一般在培養(yǎng)第5～6天才開(kāi)始,不像嗅球OECs24h后就大量貼壁生

6、長(zhǎng)。所以在這段時(shí)間內(nèi)換液應(yīng)十分小心,盡量不要晃動(dòng)培養(yǎng)液,以保持細(xì)胞沉淀,根據(jù)情況最好行1/3量換液或根據(jù)培養(yǎng)液的顏色添加培養(yǎng)液,以免丟失細(xì)胞。純化：按改良Nash差速貼壁法在培養(yǎng)36～48h后,將培養(yǎng)液吸出,重新種植于包被多聚右旋賴(lài)氨酸的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi),進(jìn)行純化培養(yǎng)。純化培養(yǎng)液中可加入20μmol/L的Forskolin和20μg/ml的BPE(bovinepituitaryextract)以促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)培養(yǎng)14天,其間觀(guān)察細(xì)胞生長(zhǎng)情況,間或攝片。成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)可機(jī)械刮除亦可用5μmol/LArac處理24h來(lái)控制。Arac對(duì)OECS

7、的生長(zhǎng)也有抑制作用，故有學(xué)者也不主張使用。是否純化的觀(guān)點(diǎn)：有部分學(xué)者認(rèn)為根據(jù)嗅黏膜細(xì)胞的社會(huì)學(xué)特性,即各種細(xì)胞之間存在著相互依存、相互誘導(dǎo)、相互制約的調(diào)節(jié)機(jī)制。嗅黏膜神經(jīng)干細(xì)胞和嗅鞘細(xì)胞體外培養(yǎng)時(shí),不宜過(guò)早地純化細(xì)胞,混合細(xì)胞培養(yǎng)更有利于各細(xì)胞成分的分裂、增殖尤其是有利于神經(jīng)干細(xì)胞克隆球的形成。Shou等〔7〕將嗅上皮細(xì)胞與其基底細(xì)胞共培養(yǎng)發(fā)現(xiàn),后者能促進(jìn)神經(jīng)前體細(xì)胞的增生,其實(shí)驗(yàn)結(jié)果從另一側(cè)面證明了上述觀(guān)點(diǎn)。　　4嗅黏膜細(xì)胞的免疫細(xì)胞化學(xué)染色目前常用的染色方法主要有：Nestin染色、NSE染色、GFAP及p75NGFR染色等，體外培養(yǎng)的時(shí)

8、間不同，免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞形態(tài)亦不相同，成熟的嗅鞘細(xì)胞大多為梭形雙極細(xì)胞,突起細(xì)長(zhǎng),其走向具有明顯的方向性,細(xì)胞排列成束?！　?原代培養(yǎng)嗅黏膜細(xì)胞的生長(zhǎng)特點(diǎn)嗅黏膜細(xì)胞