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1、中文摘要目的：流行性乙型腦炎是危害人類健康比較嚴重的蟲媒病毒。盡管目前乙腦的發(fā)病率有所下降，但發(fā)病區(qū)域仍呈現(xiàn)不斷擴大的趨勢。加強乙腦的監(jiān)測，就可以評估該地區(qū)乙腦的流行狀況。蚊子是JEV的主要傳播媒介，對蚊子的流行性乙型腦炎病毒和蟲媒病毒進行分子流行病學監(jiān)測，對疾病預(yù)防具有防范意義。方法：首先將云南省景洪縣采集15份蚊蟲樣品研磨接種BHK-21和C6/36單層細胞，待出現(xiàn)細胞病變。提取病毒RNA，并反轉(zhuǎn)錄cDNA進行PCR鑒定將目的基克隆到pMD18-T載體，送上海生工測序。同時進行蓋塔病毒、辛德畢斯、基孔肯雅病毒的PCR鑒定，回
2、收并測序。在此基礎(chǔ)上構(gòu)建了乙腦基因I型標準質(zhì)粒，建立了基于SYBRGreenI染料的Real-timePCR檢測方法，選取Ct值制作標準曲線。結(jié)果：乙腦PCR擴增目的基因經(jīng)測序驗證為乙腦基因I型，然后構(gòu)建應(yīng)用熒光定量PCR標準質(zhì)粒。研究建立的標準曲線能夠準確定量目的基因，線性相關(guān)度很高，呈現(xiàn)良好的重復(fù)性，熔解曲線為單一峰型，未出現(xiàn)非特異性擴增。SYBRGreenIReal-timePCR與傳統(tǒng)方法相比靈敏度要高10倍，而且與豬藍耳病毒等，均不發(fā)生非特異性擴增，具有良好的特異性。結(jié)論：鑒定了基因I型乙腦病毒，并構(gòu)建了快速檢測乙腦I
3、型的檢測方法。通過實驗初步驗證了其具備良好的靈敏性和重復(fù)性，為以后乙腦的流行病學調(diào)查奠定了基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞：乙型腦炎病毒基因I型蟲媒病毒熒光定量PCR前言乙型腦炎病毒，主要引起病毒性腦炎，每年可導致10,000–15,000人死亡，然而乙型腦炎是一個被忽視的熱帶病。本病容易引發(fā)中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，臨床上以高熱、意識障礙、呼吸衰竭等神經(jīng)癥狀為特征，具有明顯的季節(jié)性和地域性。本病的致死率為25-30%，相當一部分為嬰兒，50%可造成永久性后遺癥。乙型腦炎病毒分布區(qū)域已經(jīng)廣泛而且還在不斷地向亞洲和大洋洲區(qū)域擴展，因此乙型腦炎病毒被認為是新發(fā)
4、和再度出現(xiàn)的病原菌。盡管有許多有效的免疫措施，乙型腦炎依然是一個影響全球健康的疾病。乙型腦炎病毒可能是通過野生或者馴養(yǎng)的環(huán)境傳播前者，主要是野鳥作為擴散宿主，后者主要是豬作為擴散宿主。庫蚊，特別是三帶喙庫蚊，是最主要的媒介。乙腦目前有5個基因型流行，研究發(fā)現(xiàn)基因型I已經(jīng)取代基因型III為主導乙腦病毒基因型。在據(jù)報道在1949年中國大陸的報道了第一個JE病例，之后中國有成為亞洲的高度流行區(qū)。20世紀50年代以來，100余株乙腦病毒從不同的宿主分離到。因此JE是在中國法律上報告?zhèn)魅静?。雖然近年來乙腦的發(fā)病率和死亡率均下降，但對于在中
5、國流行的乙腦病毒各地方株之間的差異所知甚少。蟲媒病毒由蚊子和蜱傳播的疾病。蟲媒病毒主要分布于溫帶、熱帶和亞熱帶，世界上大多數(shù)地區(qū)都有蟲媒病毒的分離。蟲媒病毒引起諸多癥狀如全身性發(fā)熱、關(guān)節(jié)炎、出血和腦炎等,甚至導致神經(jīng)麻痹及損傷，嚴重的還可以引起死亡。蟲媒疾病的發(fā)病率一般隨季節(jié)性變化，受溫度或降雨的波動影響及脊椎動物宿主豐富程度。疫情發(fā)生則是當環(huán)境條件有利于蟲媒病毒傳播周期內(nèi)顯著擴增。近年來隨著中國與東盟等國家的貿(mào)易、旅游等活動的進一步發(fā)展，中國存在著蟲媒病毒暴發(fā)的風險本研究選取在云南省報道過的蟲媒病毒，蓋塔病毒、基孔肯雅和辛德畢
6、斯，進行分子生物學調(diào)查和病毒分離。文獻綜述1乙型腦炎病毒的研究進展流行性乙型腦炎（乙腦）又稱日本乙型腦炎病毒（Japaneseencephalitisvirus，JEV）是由蚊子傳播的病毒性腦炎疾病，嚴重危害人類的健康。過去的幾十年，動物傳染性疾病（由野生或飼養(yǎng)動物傳染給人）的發(fā)病率顯著增加了70%或更多[1]。乙型腦炎病毒作為為親神經(jīng)的黃病毒科黃病毒屬成員，可通過蚊子將病毒從動物傳播給人。在人類中，這種人畜共患疾病在世界范圍內(nèi)引起流行性病毒性腦炎，影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS)[2-3]。有關(guān)乙型腦炎的發(fā)病機理和本病的臨床表現(xiàn)（包
7、括嚴重的神經(jīng)癥狀）的一些因素已被深入研究[4-5]。本病潛伏期為5-15天，乙型腦炎的致死率為25-30%，相當一部分為嬰兒，50%可造成永久性后遺癥。1871年在日本，乙型腦炎第一次發(fā)現(xiàn)[6]。盡管1941年研究出了有效疫苗，而且隨著的國家性的免疫措施大大降低了乙型腦炎的發(fā)病率，但仍有一些零星感染事件發(fā)生，而且在南亞，東亞，東南亞以及大洋洲地區(qū)仍舊廣泛地傳播[7]。目前，超過30億人生活在乙型腦炎流行的國家。雖然所有年齡段的人都可能感染乙型腦炎病毒，但兒童乙型腦炎的發(fā)病率更高，這主要是因為大部分成年人具有免疫力[8]。目前，每
8、年大約有68000例乙型腦炎，至少導致10000-15000人死亡[9-10]。1.1乙腦基因結(jié)構(gòu)日本腦炎病毒是黃病毒科家族成員，是單股正鏈RNA病毒[11]，外面有衣殼包被,呈二十面體結(jié)構(gòu)。乙腦基因組大約11kb，包含一個開放閱讀框（ORF）編碼的蛋白。整個基
