《小動(dòng)物活體成像》ppt課件

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1、張嚴(yán)2013.7.15動(dòng)物活體成像技術(shù)ANIMALVIVOIMAGINGTECHNOLOGY概述動(dòng)物活體成像技術(shù)是指應(yīng)用影像學(xué)方法,對(duì)活體狀態(tài)下的生物過(guò)程進(jìn)行組織、細(xì)胞和分子水平的定性和定量研究。動(dòng)物活體成像技術(shù)主要分為：可見(jiàn)光成像(opticalimaging)核素成像(PETPSPECT)核磁共振成像(magneticresonanceimaging,MRI)計(jì)算機(jī)斷層攝影(computedtomography,CT)成像超聲(ultrasound)成像可見(jiàn)光成像體內(nèi)可見(jiàn)光成像包括生物發(fā)光與熒光兩種技術(shù)。生物發(fā)光技術(shù)是用熒光素酶基因標(biāo)記DNA，

2、利用其產(chǎn)生的蛋白酶與相應(yīng)的底物發(fā)生生化反應(yīng)，產(chǎn)生生物體內(nèi)的光信號(hào)。熒光技術(shù)則采用熒光報(bào)告基因(GFP、RFP)或熒光染料(包括熒光量子點(diǎn)等新型納米標(biāo)記材料)進(jìn)行標(biāo)記,利用報(bào)告基因產(chǎn)生的生物發(fā)光、熒光蛋白質(zhì)或染料產(chǎn)生的熒光,就可以形成體內(nèi)的生物光源。生物發(fā)光哺乳動(dòng)物生物發(fā)光，是將熒光素酶基因整合到細(xì)胞的基因組DNA上，產(chǎn)生穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶的細(xì)胞株，當(dāng)細(xì)胞分裂、轉(zhuǎn)移、分化時(shí)，熒光素酶也會(huì)得到持續(xù)穩(wěn)定的表達(dá)。螢火蟲(chóng)熒光素酶海腎熒光素酶底物：熒光素腔腸素發(fā)射波長(zhǎng)：540~600nm460~540nm體內(nèi)的代謝較慢，而且特異性好活體生物發(fā)光成像技術(shù)應(yīng)用1.腫

3、瘤學(xué)直接快速的測(cè)量各種癌癥模型中腫瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移以及對(duì)藥物的反應(yīng)。其特點(diǎn)是極高的靈敏度使微小的腫瘤病灶（少到幾百個(gè)細(xì)胞）也可以被檢測(cè)到。上圖：腫瘤的長(zhǎng)期檢測(cè)，分別是7d、14d、21d成像2.藥物研究熒光素酶癌癥模型可用于癌癥體內(nèi)用藥在整體動(dòng)物水平上進(jìn)行長(zhǎng)期療效跟蹤觀察。利用無(wú)創(chuàng)傷活體成像對(duì)癌細(xì)胞生長(zhǎng)的檢測(cè)，可對(duì)癌癥治療之前和過(guò)程中的癌細(xì)胞的變化進(jìn)行實(shí)時(shí)觀測(cè)和評(píng)估。利用活體成像技術(shù)高靈敏度、觀察方便的特點(diǎn)，在抗腫瘤藥物臨床前研究中，通過(guò)給予腫瘤接種的小鼠不同劑量，不同給藥時(shí)間、不同給藥途徑，觀察抗腫瘤藥物的最佳給藥途徑、給藥劑量及給藥時(shí)間，從而制定

4、合適的劑型與服藥時(shí)間。3.基因治療基因治療是將正?；蚧蛴兄委熥饔玫幕蛲ㄟ^(guò)一定方式導(dǎo)入靶細(xì)胞以糾正基因的缺陷或者發(fā)揮治療作用，從而達(dá)到治療疾病目的。目前，基因治療主要是以病毒做載體，可應(yīng)用熒光素酶基因作為報(bào)告基因加入載體，觀察目的基因是否到達(dá)動(dòng)物體內(nèi)的特異組織和是否持續(xù)高效表達(dá)，這種非侵入方式具有低毒性及免疫反應(yīng)輕微等優(yōu)點(diǎn)且可以直接實(shí)時(shí)觀察，了解病毒或載體侵染的部位和時(shí)域信息。4.干細(xì)胞及免疫學(xué)用熒光素酶標(biāo)記干細(xì)胞有兩種方法：一種是標(biāo)記組成性表達(dá)的基因，做成轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，干細(xì)胞就被標(biāo)記了，若干細(xì)胞移植到另外動(dòng)物體內(nèi)，可以用活體生物發(fā)光成像技術(shù)示蹤干

5、細(xì)胞在體內(nèi)的增殖、分化及遷徙的過(guò)程；另外一種方法是用慢病毒直接標(biāo)記干細(xì)胞后，移植到體內(nèi)觀測(cè)其增殖、分化及遷徙過(guò)程，研究其修復(fù)、治療損傷或缺陷部分的效果，進(jìn)一步探討其機(jī)制。標(biāo)記免疫細(xì)胞，觀察免疫細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞等的識(shí)別和殺死功能，評(píng)價(jià)免疫細(xì)胞的免疫特異性、增殖、遷移及功能等。5.基因表達(dá)模式與基因功能研究為研究目的基因是在何時(shí)、何種刺激下表達(dá)，將熒光素酶基因插入目的基因啟動(dòng)子的下游，并穩(wěn)定整合于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物染色體中，形成轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型，觀察目的基因的表達(dá)模式。6.蛋白質(zhì)相互作用原理是將分開(kāi)時(shí)都不單獨(dú)發(fā)光的熒光酶的C端和N端分別連接在兩個(gè)不同的蛋白質(zhì)上，若是

6、這兩個(gè)蛋白質(zhì)之間有相互作用，熒光酶的C端和N端就會(huì)被連接到一起，激活熒光素酶的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，在有底物存在時(shí)出現(xiàn)生物發(fā)光。7.細(xì)胞凋亡原理是用分子生物學(xué)方法在熒光酶的兩端連接上抑制其發(fā)光的蛋白(如雌激素)，但在其連接處加上caspase(細(xì)胞凋亡時(shí)特異表達(dá)的一種酶)的酶切點(diǎn)。細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，表達(dá)caspase，切開(kāi)抑制熒光酶發(fā)光的蛋白，使熒光素酶開(kāi)始發(fā)光。8.疾病機(jī)理可以標(biāo)記與某種疾病密切相關(guān)的基因，做成轉(zhuǎn)基因小鼠，通過(guò)特定的藥物作用或其他條件下該基因表達(dá)的變化，來(lái)推測(cè)該疾病的發(fā)病機(jī)理和藥物對(duì)疾病治療的效果等。熒光成像熒光技術(shù)則采用綠色熒光蛋白(GFP)

7、、紅色熒光蛋白R(shí)FP)等熒光報(bào)告基因和FITC、Cy5、Cy7等熒光素及量子點(diǎn)(quantumdot，QD)進(jìn)行標(biāo)記，利用一套非常靈敏的光學(xué)檢測(cè)儀器，讓研究人員能夠直接監(jiān)控活體生物體內(nèi)的細(xì)胞活動(dòng)和基因行為。紅光的穿透性在體內(nèi)比藍(lán)綠光的穿透性效率高，近紅外熒光（700-800nm）避開(kāi)了生物個(gè)體在可見(jiàn)熒光區(qū)的本底信號(hào)，是成像觀察的最佳選擇?；铙w動(dòng)物熒光成像技術(shù)應(yīng)用1.腫瘤學(xué)活體熒光成像技術(shù)能夠無(wú)創(chuàng)傷定量檢測(cè)小鼠的皮下瘤模型。相對(duì)于生物發(fā)光成像技術(shù)，活體熒光成像技術(shù)檢測(cè)時(shí)間較快，只需要不到1s的時(shí)間，同時(shí)不需要注射底物，節(jié)約了檢測(cè)成本。左圖：通過(guò)H-4

8、60-GFP皮下腫瘤模型，建立小鼠肺癌的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，可用?lái)進(jìn)行有關(guān)抗癌藥物的篩選（圖1）?？捎糜跍y(cè)量皮下腫瘤的生長(zhǎng)和監(jiān)測(cè)對(duì)潛