紫花苜蓿MsIPI基因克隆及對煙草的遺傳轉化

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1、摘要紫花苜蓿重要次生代謝產物皂苷屬萜類化合物，異戊烯基焦磷酸異構酶(isopentenyldiphosphateisomerase,簡稱IPI)是植物體萜類化合物合成途徑中的一個關鍵酶，其作用是將直接用于萜類合成的兩個基本物質IPP和他的異構物DMAPP在一定條件下進行相互轉化。紫花苜蓿是優(yōu)良的豆科牧草，目前在我國及世界各地都有大量栽培利用，其中所含皂苷具有重要的生物活性和藥理作用。通過對異戊烯基焦磷酸異構酶基因的研究，對于提高和控制其在植物體內的生化活性具有重要意義。對已公布的異戊烯基焦磷酸異構酶EST序列進行搜索和比對，選取了與紫花苜蓿親緣關系最近的蒺藜苜蓿的IPI基因EST序列為基準設

2、計引物，利用RT-PCR技術，擴增獲得MsIPI基因cDNA全序列。該基因開放閱讀框全長870bp，編碼290個氨基酸殘基。利用DNAMAN對該基因的氨基酸序列進行了生物性息學分析，經(jīng)同源比對和進化樹分析，MsIPI基因的氨基酸序列與蒺藜苜蓿、煙草、擬南芥、水稻、高粱的異戊烯基焦磷酸異構酶氨基酸序列一致性達到90℅以上。植物的表達載體構建，是將獲得的EST序列插入到植物表達載體pBI121上，構建了超表達MsIPI基因的表達載體pBI-IPI，再通過農桿菌介導法轉化農桿菌，利用葉盤法轉化煙草，以期得到MsIPI基因超量表達的煙草轉基因植株。對再生植株進行抗生素篩選和PCR、RT-PCR檢測，

3、結果6株呈現(xiàn)陽性，證實目的基因已經(jīng)整合到煙草基因組中，已獲得了轉基因植株。通過GUS基因組織化學染色檢測，初步證實該基因可以順利轉錄。關鍵詞：紫花苜蓿；異戊烯基焦磷酸異構酶；基因克?。惠d體構建；煙草轉化CloningofMsIPIGenefromAlfalfa(MedicagosativaL.)andTransformationofTobaccosAbstractSaponinsfromMedicagospeciesarepentacyclictriterpenes,andtheyareofthemostimportantsecondarymetabolitesofMedicagosativ

4、alL..Isopentenyldiphosphateisomerase(IPI)isakeyenzymeworkinginthebiosynthesisprogressofterpenoidsinplants,anditplaysanimportantroleinintroconvertingIPPanditsisomerDMAPPintoeachotherundercertainconditions.Medicagosatival.LisaneximiousleguminousforagewhichhasbeenplantedwidelyinChinaandallovertheworld

5、.SaponinsfromM.sativalL.takespecialpharmacologicaleffectsfortheirparticularbiologicalactivities.MsIPIisakeygenecontrollingbiosynthesisofsaponinsinMedicagospecies.Researchonthisgeneisofgreatimportanceincontrollingandimprovingbiochemicalactivitiesofsaponinsinplants.Bysearchingandcomparingthepublicate

6、dIsopentenylpyrophosphateisomeraseESTsequences,ESTsequencesoftheIPIgenefromTribulusterrestrisL.whichhastheclosestgeneticrelationshipwithM.sativalwasusedtodesignreferenceprimers.MsIPIwasamplifiedbyRT-PCRtoobtainafulllengthofcDNA.ThecDNAsequenceincludeda870bpopenreadingframewhichencoded290aminoacidre

7、sidues.AcomparisonoftheaminoacidsequenceswascarriedoutbyDNAmantoanalysetheirbiologicalinformation,theresultsshowedthattherewasasimilarityofmorethan90%betweentheaminoacidsequencesandthoseinTribulusterrestris