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1、巢式PCR檢測(cè)梅毒螺旋體的應(yīng)用分析摘要：目的：探討巢式PCR在梅毒螺旋體(Treponemapallidum,TP)檢測(cè)中的應(yīng)用價(jià)值。方法：本文采用巢式PCR檢測(cè)梅毒螺旋體，并與常規(guī)PCR檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較研究。結(jié)果：半巢式polAPCR檢測(cè)出陽(yáng)性37例，陽(yáng)性率達(dá)30.83%(37/120),常規(guī)polAPCR檢測(cè)出陽(yáng)性7例，陽(yáng)性率達(dá)5.83%(7/120)，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)半巢式polAPCR檢測(cè)結(jié)果與常規(guī)polAPCR檢測(cè)結(jié)果比較有顯著性差異，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(X2=30.68，P=0.00)。這表明半巢式PCR靈敏度遠(yuǎn)高于常規(guī)PCR。結(jié)論：半巢式polAPCR具有高度
2、敏感、特異、標(biāo)本處理簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，適用于檢測(cè)血清等標(biāo)本中微量Tp，可作為血清學(xué)方法的補(bǔ)充用于梅毒診斷。關(guān)鍵詞：巢式PCR梅毒螺旋體【中圖分類號(hào)】R9【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】B【文章編號(hào)】167H8801(2013)11-0538-01我院于2008年9月?2010年9月采用巢式PCR檢測(cè)梅毒螺旋體，并與常規(guī)PCR檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較研究，為梅毒的預(yù)防和分子流行病學(xué)研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。1資料與方法1.1一般資料。本研究共收集2008年9月?2010年9月在120例可疑梅毒及有不潔性接觸史的非梅毒患者的全血及相應(yīng)的血清標(biāo)本，其中男75例，女45例；年齡19?57歲，平均年齡(29.6±10.3)
3、歲；入選的患者均自愿參加本次研究。1.2方法。①標(biāo)本收集：用KUBOTA8410型和8420型離心機(jī)對(duì)血液標(biāo)本離心，1800r/min、lOmin。試管離心后，在生物安全柜中開(kāi)蓋，整齊擺放在AT試管架上。吸取血漿放入離心管，閉蓋，-20度保存，用于PCR檢測(cè)［1］。②DNA模板制備：Tp用DNAMinikit從兔睪丸培養(yǎng)物稀釋液中提取模板；對(duì)照的微生物用DNAMinikit從培養(yǎng)物中提取模板;臨床血清標(biāo)本分別用DNAMinikit煮沸法提取模板。③引物設(shè)計(jì)：根據(jù)TppolA基因序列(GenbankTPU57757)，設(shè)計(jì)了4條引物，即Pl:CGTCTGGTCGATGTGCA
4、AATGAGTG,P2:CACAGTGCTCAAAAACGCCTGCACG，P3:TGCGCGTGTGCGAATGGTGTGGTC，P4:TGCACATGTACACTGAGTTGACTCGG。④常規(guī)PCR擴(kuò)增polA基因：反應(yīng)體系為25uL：IXPCR緩沖液(1.5moL/LMgC12)，dNTPsO.2mmol/L，引物P3和P20.5umol/L,Taq酶0.5U，DNA模板2uL。反應(yīng)條件：94°C5min；94°C15s，65°C30s,72°C45s，循環(huán)35次；72°C延伸5min。⑤半巢式PCR擴(kuò)增polA基因：反應(yīng)體系為25uL：IXPCR緩沖液(1.5mo
5、L/LMgC12),dNTPsO.2mmol/L,引物0.5Umol/L,Taq酶0.5U，DNA模板2uL(外循環(huán))或luL(內(nèi)循環(huán))。反應(yīng)條件：外循環(huán)以P1和P2為引物，94°C5min；94°C15s,56°C30s,72°C45s,循環(huán)20次；72°C延伸5min；內(nèi)循環(huán)：以P3和P4為引物，94°C5min；94°C15s,56°C30s,72°C45s。循環(huán)30次；72°C延伸7min。1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。使用SPSS13.0對(duì)各項(xiàng)資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)、分析，計(jì)量資料以均值土標(biāo)準(zhǔn)差(X土S)表示，計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用X2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2
6、結(jié)果由表2可知，半巢式polAPCR檢測(cè)出陽(yáng)性37例，陽(yáng)性率達(dá)30.83%(37/120)，常規(guī)polAPCR檢測(cè)出陽(yáng)性7例，陽(yáng)性率達(dá)5.83%(7/120)，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)半巢式polAPCR檢測(cè)結(jié)果與常規(guī)polAPCR檢測(cè)結(jié)果比較有顯著性差異，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(X2=30.68,P=0.00)。這表明半巢式PCR靈敏度遠(yuǎn)高于常規(guī)PCR。3討論梅毒(syphilis)是由密螺旋體屬蒼白螺旋體(Treponemapallidum,TP)的蒼白亞種(又稱梅毒螺旋體)引起的、對(duì)人類健康具有較為嚴(yán)重危害的一種性傳播疾病[2]。直接檢測(cè)梅毒螺旋體常用暗視野或免疫熒光染色鏡檢，但
7、敏感性低且結(jié)果判斷易受主觀影響。聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)是檢測(cè)Tp的有效方法［3］。本文采用巢式PCR檢測(cè)梅毒螺旋體，并與常規(guī)PCR檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)半巢式polAPCR檢測(cè)出陽(yáng)性37例，陽(yáng)性率迗30.83%(37/120)，常規(guī)polAPCR檢測(cè)出陽(yáng)性7例，陽(yáng)性率迗5.83%(7/120)，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)半巢式polAPCR檢測(cè)結(jié)果與常規(guī)polAPCR檢測(cè)結(jié)果比較有顯著性差異，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(X2=30.68，P=0.00)。這表明半巢式PCR靈敏度遠(yuǎn)高于常規(guī)PCRo因此，半巢式polAPCR具有
