化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)1

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1、第十章化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)第十章化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)第一節(jié)慨述一、化學(xué)發(fā)光二、化學(xué)發(fā)光效率第二節(jié)化學(xué)發(fā)光劑和標(biāo)記技術(shù)一、化學(xué)發(fā)光劑二、發(fā)光劑的標(biāo)記技術(shù)第三節(jié)化學(xué)發(fā)光免疫分析的類型一、直接化學(xué)發(fā)光免疫分析二、化學(xué)發(fā)光酶免疫分析三、電化學(xué)發(fā)光免疫分析四、臨床應(yīng)用思考題小結(jié)發(fā)光免疫分析:是將發(fā)光分析和免疫反應(yīng)相結(jié)合而建立起來(lái)的一種新的檢測(cè)微量抗原或抗體的新型標(biāo)記免疫分析技術(shù)。第一節(jié)概述放射免疫技術(shù)酶免疫技術(shù)發(fā)光免疫技術(shù)三大經(jīng)典標(biāo)記技術(shù)發(fā)光:是指分子或原子中的電子吸收能量后，由基態(tài)（較低能級(jí)）躍遷到激發(fā)態(tài)（較高能級(jí)），然后再返回到基態(tài)，并釋放光子的過(guò)程。根據(jù)形成激發(fā)態(tài)分子的能量來(lái)源不同可分為:光照

2、發(fā)光、生物發(fā)光、化學(xué)發(fā)光等。光照發(fā)光（photoluminescence）是指發(fā)光劑（熒光素）經(jīng)短波長(zhǎng)的入射光照射后，電子吸收能量躍遷到激發(fā)態(tài)，在其回復(fù)至基態(tài)時(shí)，發(fā)射出較長(zhǎng)波長(zhǎng)的可見(jiàn)光（熒光）。生物發(fā)光（bioluminescence）是指發(fā)生在生物體內(nèi)的發(fā)光現(xiàn)象，如螢火蟲的發(fā)光，反應(yīng)底物為螢火蟲熒光素，在熒光素酶的催化下，利用ATP能，生成激發(fā)態(tài)氧化型熒光素，它在回復(fù)基態(tài)時(shí)多余的能量以光子的形式釋放出來(lái)?；瘜W(xué)發(fā)光（chemiluminescence）是指伴隨化學(xué)反應(yīng)過(guò)程所產(chǎn)生的光的發(fā)射現(xiàn)象。某些物質(zhì)(發(fā)光劑)在化學(xué)反應(yīng)時(shí)，吸收了反應(yīng)過(guò)程中所產(chǎn)生的化學(xué)能，使反應(yīng)的產(chǎn)物分子或反應(yīng)的中間態(tài)分子中

3、的電子躍遷到激發(fā)態(tài)，當(dāng)電子從激發(fā)態(tài)回復(fù)到基態(tài)時(shí)，以發(fā)射光子的形式釋放出能量，這一現(xiàn)象稱為化學(xué)發(fā)光。一、化學(xué)發(fā)光一些化學(xué)反應(yīng)能釋放足夠的能量把參加反應(yīng)的物質(zhì)激發(fā)到能發(fā)射光的電子激發(fā)態(tài)，若被激發(fā)的是一個(gè)反應(yīng)產(chǎn)物分子，則這種反應(yīng)過(guò)程叫直接化學(xué)發(fā)光。反應(yīng)過(guò)程可簡(jiǎn)單地描述如下：A十BC*C*C＋h·γ其中γ為光子，C*表示C處于單線激發(fā)態(tài)。若激發(fā)能傳遞到另一個(gè)未參加化學(xué)反應(yīng)的分子D上，使D分子激發(fā)到電子激發(fā)態(tài)，D分子從激發(fā)態(tài)回到基態(tài)時(shí)發(fā)光，這種過(guò)程叫間接化學(xué)發(fā)光。反應(yīng)過(guò)程可表示如下：A十BC*C*十DC十D*D*D十h·γ化學(xué)發(fā)光效率決定于生成激發(fā)態(tài)產(chǎn)物分子的化學(xué)激發(fā)效率（φCE）和激發(fā)態(tài)分子的發(fā)射效

4、率（φEM）。化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的發(fā)光效率、光輻射的能量大小以及光譜范圍，完全由發(fā)光物質(zhì)的性質(zhì)所決定，每一個(gè)發(fā)光反應(yīng)都具有其特征性的化學(xué)發(fā)光光譜和不同的化學(xué)發(fā)光效率。二、化學(xué)發(fā)光效率第二節(jié)化學(xué)發(fā)光劑和標(biāo)記技術(shù)在化學(xué)發(fā)光反應(yīng)中參與能量轉(zhuǎn)移并最終以發(fā)射光子的形式釋放能量的化合物，稱為化學(xué)發(fā)光劑或發(fā)光底物。一、化學(xué)發(fā)光劑能作為化學(xué)發(fā)光劑的條件：①發(fā)光的量子產(chǎn)率高；②它的物理-化學(xué)特性要與被標(biāo)記或測(cè)定的物質(zhì)相匹配；③能與抗原或抗體形成穩(wěn)定的偶聯(lián)結(jié)合物；④其化學(xué)發(fā)光常是氧化反應(yīng)的結(jié)果；⑤在所使用的濃度范圍內(nèi)對(duì)生物體沒(méi)有毒性。㈠直接化學(xué)發(fā)光劑直接化學(xué)發(fā)光劑在發(fā)光免疫分析過(guò)程中不需酶的催化作用，直接參與發(fā)光反應(yīng)

5、，它們?cè)诨瘜W(xué)結(jié)構(gòu)上有產(chǎn)生發(fā)光的特有基團(tuán)，可直接標(biāo)記抗原或抗體。1.吖啶酯在堿性條件下被H2O2氧化時(shí),發(fā)出波長(zhǎng)為470nm的光，具有很高的發(fā)光效率，其激發(fā)態(tài)產(chǎn)物N-甲基吖啶酮是該發(fā)光反應(yīng)體系的發(fā)光體。2．三聯(lián)吡啶釕三聯(lián)吡啶釕[RU(bpy)3]2+是電化學(xué)發(fā)光劑，它和電子供體三丙胺（TPA）在陽(yáng)電極表面可同時(shí)失去一個(gè)電子而發(fā)生氧化反應(yīng)。三聯(lián)吡啶釕電化學(xué)發(fā)光劑反應(yīng)原理㈡酶促反應(yīng)發(fā)光劑：是利用標(biāo)記酶的催化作用，使發(fā)光劑（底物）發(fā)光，這一類需酶催化后發(fā)光的發(fā)光劑稱為酶促反應(yīng)發(fā)光劑。1．魯米諾及其衍生物2．AMPPD1．魯米諾魯米諾發(fā)光原理魯米諾增強(qiáng)發(fā)光反應(yīng)原理2．AMPPD〔3-(2‘-螺旋金剛烷

6、)-4-甲氧基-4-(3“-磷酰氧基)苯-1,2-二氧雜環(huán)丁烷〕〕1.碳二亞胺（EDC）縮合法二、發(fā)光劑的標(biāo)記技術(shù)2.過(guò)碘酸鈉氧化法3．重氮鹽偶聯(lián)法4.N-羥基琥珀酰亞胺活化法1．發(fā)光劑的選擇2．被標(biāo)記蛋白質(zhì)的性質(zhì)3．標(biāo)記方法的選擇4．原料比5．標(biāo)記率6．溫度7．純化與保存影響標(biāo)記的因素第三節(jié)化學(xué)發(fā)光免疫分析的類型用吖啶酯直接標(biāo)記抗體(抗原)，與待測(cè)標(biāo)本中相應(yīng)的抗原(抗體)發(fā)生免疫反應(yīng)后，形成固相包被抗體-待測(cè)抗原-吖啶酯標(biāo)記抗體復(fù)合物，這時(shí)只需加入氧化劑（H2O2）和NaOH使成堿性環(huán)境，吖啶酯在不需要催化劑的情況下分解、發(fā)光。由集光器和光電倍增管接收、記錄單位時(shí)間內(nèi)所產(chǎn)生的光子能，這部分

7、光的積分與待測(cè)抗原的量成正比，可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出待測(cè)抗原的含量。一、直接化學(xué)發(fā)光免疫分析發(fā)光YYY磁微粒被測(cè)抗原+抗體+帶丫啶酯標(biāo)記物抗體YYYYYYYYYYY沖洗后---夾心法（1）加入H2O2（pH<10）（2）加入堿（pH>10）直接化學(xué)發(fā)光的機(jī)理磁微粒模式圖YYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYYY特點(diǎn)抗原和抗體結(jié)合與未結(jié)合部分的易分離磁微粒技術(shù)化學(xué)發(fā)光酶免疫分析（che