感受態(tài)細胞的制備和重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化

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1、1.掌握用CaCl2法制備感受態(tài)細胞的原理和方法。2.學習和掌握質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化和重組質(zhì)粒的篩選方法?！緦嶒炘怼抠|(zhì)粒在不同的細菌之間轉(zhuǎn)移是微生物世界中一種普遍的現(xiàn)象，一個細菌品系通過吸收另一個細菌品系的質(zhì)粒DNA而發(fā)生了遺傳性狀的改變，這種現(xiàn)象叫做轉(zhuǎn)化，獲得了外源DNA的細胞稱為轉(zhuǎn)化子。在基因克隆技術(shù)中，所謂轉(zhuǎn)化是指質(zhì)?；蛑亟M質(zhì)粒被導入受體細胞，表達相應的選擇標記基因，并在一定的培養(yǎng)條件下，在選擇性培養(yǎng)基上長出轉(zhuǎn)化子的過程。質(zhì)粒必須通過轉(zhuǎn)化進入細菌細胞內(nèi)，才能進行擴增和表達，從而獲得大量的克隆基因,使我們能夠進行進一步的DNA操作，如亞克隆等；或者獲得其

2、表達產(chǎn)物。轉(zhuǎn)化效率的高低與受體菌的生理狀態(tài)有關(guān)。細菌吸收外源DNA的能力最高時的狀態(tài)被稱為感受態(tài)細胞（competentcell）。有些種類的細菌在其生長的任一階段都處于感受態(tài)，而另一些細菌只有處于某個生長時期時（一般為對數(shù)生長早、中期），才會處于感受態(tài),如本實驗所用的大腸桿菌。用一定濃度的CaCl2處理對數(shù)生長早中期的細菌可以大大提高細菌吸收周圍環(huán)境中的DNA分子的能力。對這種現(xiàn)象的一種解釋是CaCl2能使細菌細胞壁的通透性增強，從而提高轉(zhuǎn)化率。這種轉(zhuǎn)化方法稱為“化學法”。目前還可以使用電激的方法，通過瞬間的高壓電流，在細胞上形成孔洞，使外源DNA進入胞

3、內(nèi)，從而實現(xiàn)細胞的轉(zhuǎn)化。電激轉(zhuǎn)化的效率往往比化學法高出1到2個數(shù)量級，達到1x108轉(zhuǎn)化子/μgDNA，甚至1x109轉(zhuǎn)化子/μgDNA，所以常用于文庫構(gòu)建時的轉(zhuǎn)化或遺傳篩選。微生物轉(zhuǎn)化是基因工程的常用技術(shù)，大腸桿菌是基因工程中最常用的受體菌，本實驗即是用前面實驗獲得的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌細胞?！驹噭┡c器材】〈一〉試劑1．LB液體培養(yǎng)基:參見附錄????每組配200mL,其中100mL分裝于500mL三角瓶中，另各取3mL裝于2只大試管中，其余裝于裝于500mL三角瓶中，121℃高壓蒸汽滅菌20分鐘。2．LB/Amp/IPTG/X-Gal平板（1）:配1L

4、LB液體培養(yǎng)基，加入20g瓊脂粉和1支攪拌棒，同上高壓滅菌，趁熱取出置攪拌器上冷卻，待冷至55℃左右,加氨芐青霉素(Ampicillin)至終濃度100μg/ml(Amp儲存液一般為100mg/mL),倒平板，每皿倒約15mL，室溫放置過夜至冷凝水揮發(fā)干凈。使用前半小時在培養(yǎng)基表面加20μL50mg/mLX-gal和100μL0.1mol/LIPTG，涂勻，待這兩種化合物滲入瓊脂后，即可用于轉(zhuǎn)化菌的涂布。?每組制備LB平板2個，LB/Amp平板5個，LB/Amp/IPTG/X-Gal平板6個。3．IPTG儲存液(0.1mol/L)：1.2gIPTG加水至5

5、0ml，過濾除菌，4℃儲存。4．X-gal儲存液：50mg/ml溶于二甲基甲酰胺溶劑中，過濾除菌，4℃儲存。5．1mol/LCaCl2儲存液，使用濃度為0.1mol/L，CaCl2應使用分析純，配100mL，高壓滅菌，全班用。6．甘油(滅菌)，全班50mL，同上高壓滅菌。7．酸洗無菌玻璃珠，涂布平板用，用50mL三角瓶分裝，同上高壓滅菌，烘干備用?！炊灯鞑?.37℃溫箱、水浴鍋、恒溫振蕩器等2.高速冷凍離心機3.微量移液器等〈三〉菌株?大腸桿菌DH5α，基因型為【操作方法】1、感受態(tài)細胞的制備（無菌操作）:1）從新鮮培養(yǎng)的LB平板上挑單個DH5α大菌落接

6、種到3mLLB培養(yǎng)液中（2），37℃劇烈振蕩（210-240r/min）培養(yǎng)過夜（3）。2）取1mL過夜培養(yǎng)物,接種到含100mLLB培養(yǎng)液的500mL錐瓶中，37℃劇烈振蕩，直至培養(yǎng)液中細菌濃度達到OD600為0.375-0.4（4）3）培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入2只50mL離心管中，冰上放置10分鐘，4,000r/min,4℃離心15分鐘，棄上清（5）。4）將菌體懸浮于10～20mL預冷的0.1mol/LCaCl2溶液中,冰上放置20分鐘(6)。5）4,000rpm,4℃,離心10分鐘，棄上清，然后將細菌輕輕懸浮在2ml0.1mol/LCaCl2溶液中（7）。若不立即

7、進行轉(zhuǎn)化實驗，則進行第6步操作，反之，則進入轉(zhuǎn)化操作。6）緩慢滴入甘油(滅菌)至終濃度為15％,輕柔混勻，將細菌分裝成0.5ml/每管，立即液氮冷凍，轉(zhuǎn)入-70℃冰箱儲存，可在2個月內(nèi)使用（8）。2、感受態(tài)細胞的轉(zhuǎn)化1）設計好實驗項目，如正、負對照（參考如下表格，按表格內(nèi)容操作）；??2）從-80℃冰箱中取出分裝成0.5mL/每管的感受態(tài)細胞,置冰上5分鐘或緩慢流水淋至剛好解凍（10），立即分裝到預冷的1.5mL離心管中，每管體積參見上表，插入冰上待用；3）對轉(zhuǎn)化管，加入連接產(chǎn)物DNA溶液，輕輕混勻；為保險起見，也可先加入一半的連接產(chǎn)物DNA溶液，輕輕混勻

8、，剩下的一半置-20℃冰箱保存；4）冰上放置30分鐘（11）；5）