資源描述:
《慢病毒載體構(gòu)建步驟的研究》由會員上傳分享,免費在線閱讀,更多相關(guān)內(nèi)容在工程資料-天天文庫。
1、實用標準文案一、簡介慢病毒(Lentivirus)載體是以HIV-1(人類免疫缺陷I型病毒)為基礎(chǔ)發(fā)展起來的基因治療載體。區(qū)別一般的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體,它對分裂細胞和非分裂細胞均具有感染能力。慢病毒載體的研究發(fā)展得很快,研究的也非常深入。該載體可以將外源基因有效地整合到宿主染色體上,從而達到持久性表達。目前慢病毒也被廣泛地應用于表達RNAi的研究中。由于有些類型細胞脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染效果差,轉(zhuǎn)移到細胞內(nèi)的siRNA半衰期短,體外合成siRNA對基因表達的抑制作用通常是短暫的,因而使其應用受到較大的限制。采用事先在體外構(gòu)建能夠表達siRNA的載體,
2、然后轉(zhuǎn)移到細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄siRNA的策略,不但使脂質(zhì)體有效轉(zhuǎn)染的細胞種類增加,而且對基因表達抑制效果也不遜色于體外合成siRNA,在長期穩(wěn)定表達載體的細胞中,甚至可以發(fā)揮長期阻斷基因表達的作用。慢病毒載體能夠產(chǎn)生表達shRNA的高滴度的慢病毒,在周期性和非周期性細胞、干細胞、受精卵以及分化的后代細胞中表達shRNA,實現(xiàn)在多種類型的細胞和轉(zhuǎn)基因小鼠中特異而穩(wěn)定的基因表達的功能性沉默,為在原代的人和動物細胞組織中快速而高效地研究基因功能,以及產(chǎn)生特定基因表達降低的動物提供了可能性。慢病毒作為siRNA的攜帶者,不但具備特異性地使基因表達沉默
3、的能力,而且充分發(fā)揮了慢病毒載體自身所具備的優(yōu)勢,為基因功能的研究提供了更強有力的工具。在所構(gòu)建的siRNA表達載體中,是由RNA聚合酶Ⅲ啟動子來指導RNA合成的,這是因為RNA聚合酶Ⅲ有明確的起始和終止序列,而且合成的RNA不會帶polyA尾。當RNA聚合酶Ⅲ遇到連續(xù)4個或5個T時,它指導的轉(zhuǎn)錄就會停止,在轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物3’端形成1~4個U。U6和H1RNA啟動子是兩種RNA聚合酶Ⅲ依賴的啟動子,其特點是啟動子自身元素均位于轉(zhuǎn)錄區(qū)的上游,適合于表達~21ntRNA和~50ntRNA莖環(huán)結(jié)構(gòu)(stemloop)。在siRNA表達載體中,構(gòu)成
4、siRNA的正義與反義鏈,可由各自的啟動子分別轉(zhuǎn)錄,然后兩條鏈互補結(jié)合形成siRNA;也可由載體直接表達小發(fā)卡狀RNA(smallhairpinRNA,shRNA),載體包含位于RNA聚合酶Ⅲ啟動子和4~5T轉(zhuǎn)錄終止位點之間的莖環(huán)結(jié)構(gòu)序列,轉(zhuǎn)錄后即可折疊成具有1~4個U3’突出端的莖環(huán)結(jié)構(gòu),在細胞內(nèi)進一步加工成siRNA。構(gòu)建載體前通常要通過合成siRNA的方法,尋找高效的siRNA,然后從中挑選符合載體要求的序列,將其引入siRNA表達載體(篩選)。二、實驗流程(大致的簡單過程)慢病毒表達載體包含了包裝、轉(zhuǎn)染、穩(wěn)定整合所需要的遺傳信
5、息。慢病毒包裝質(zhì)??商峁┧械霓D(zhuǎn)錄并包裝RNA到重組的假病毒載體所需要的所有輔助蛋白精彩文檔實用標準文案。為產(chǎn)生高滴度的病毒顆粒,需要利用表達載體(自己構(gòu)建)和包裝質(zhì)粒(購入)同時共轉(zhuǎn)染細胞,在293T細胞(購入)中進行病毒的包裝,包裝好的假病毒顆粒分泌到細胞外的培養(yǎng)基中,離心取得上清液后,可以直接用于宿主細胞的感染,目的基因進入到宿主細胞之后,經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄,整合到基因組,從而高水平的表達效應分子。?大致的實驗流程:1.根據(jù)目的基因相關(guān)信息(序列,序列號等),構(gòu)建含有外源基因或siRNA的重組載體;(即質(zhì)粒構(gòu)建,已構(gòu)建好,質(zhì)??梢杂谰帽?/p>
6、存)2.對于測序正確的重組質(zhì)粒,提取和純化高質(zhì)量的不含內(nèi)毒素的重組質(zhì)粒;3.使用高效重組載體和病毒包裝質(zhì)粒(購入)共轉(zhuǎn)染293T細胞[1],進行病毒包裝和生產(chǎn),收集病毒液;4.濃縮、純化病毒液;5.用高質(zhì)量的病毒液感染細胞(293T細胞);6.通過定量PCR精確測定病毒滴度(高精確滴定方法)和Western分析實驗結(jié)果;7.用高質(zhì)量的病毒液感染宿主細胞;檢測基因功能或者siRNA的沉默效率以及使用藥物進行穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株的篩選,通常狀況下,篩選的細胞克隆株具有長期的表達穩(wěn)定性。病毒液足夠用于一般的動物活體實驗。三、重組質(zhì)粒構(gòu)建流程1.基
7、因的獲得:shRNA寡核苷酸序列的設(shè)計和合成(將正確序列克隆入載體中,退火形成雙鏈,PCR擴增)2.回收A.酶切產(chǎn)物的膠回收:一般做50-100ul體系,然后跑電泳回收,回收量一般為30ul。B.PCR擴增產(chǎn)物的膠回收原理:首先利用低熔點瓊脂糖凝膠電泳DNA片段,分離目的條帶DNA,然后紫外光下切割含目的DNA條帶的膠塊,利用膠回收試劑盒回收純化DNA片段。試劑盒的膠回收柱采用特殊硅基質(zhì)材料在一定的高鹽緩沖系統(tǒng)下高效、專一地吸附DNA、RNA的原理,配備設(shè)計獨特的離心吸附柱式結(jié)構(gòu),使用常規(guī)臺式高速離心機,在幾分鐘之內(nèi)即可以高效回收核酸
8、片段。實驗儀器:1、瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)2、紫外觀察分析儀3、離心機4、單面刀片5、恒溫水浴鍋試劑:1、DNA回收試劑盒[2]2、50×TAE[3](電泳緩沖液Tris-乙酸)3、ddH2O4、瓊脂糖凝膠[4]步驟:1)使