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1、內(nèi)皮祖細胞的體外移植和他汀類藥物對大鼠急性肺損傷的保護作用及療效比較何薇王瑩謝斌張珊珊（黑龍江省大慶油HI總醫(yī)院163001）【屮圖分類號1R563【文獻標識碼】A【文章編號］1672-5085（2010）32-0068-05【摘要】口的探索細胞療法暨內(nèi)皮祖細胞（EPCs）移植法對急性肺損傷的治療作用，比較體外移植內(nèi)皮祖細胞、使用阿托伐他汀提高循環(huán)中內(nèi)皮祖細胞數(shù)量和活性以及二者聯(lián)合應(yīng)用三種方法的療效。方法取人臍帶血分離內(nèi)皮祖細胞，經(jīng)一周培養(yǎng)；用脂多糖（LPS）造大鼠急性肺損傷（ALI）模型，分別口服給予阿托伐他汀、尾靜脈注入BrdU標記的內(nèi)皮祖細胞及兩
2、者聯(lián)合給藥。2口后評估其肺損傷的程度、肺血管誘生型一氧化氮合酶（iNOS）的蛋白表達及免疫組化法追蹤移植內(nèi)皮祖細胞修復(fù)血管內(nèi)皮的情況。結(jié)果EPCs移植組和聯(lián)合治療組屮，免疫組化可檢測到肺血管內(nèi)皮BrdU呈陽性的移植EPCs；大鼠肺動脈中iNOS表達較LPS模型組受到抑制；肺實質(zhì)屮，屮性粒細胞（PMN）明顯減少，肺水含量、透明膜形成及肺出血均減少。而他汀治療組與LPS模型組未見明顯差異結(jié)果EPCs體外移植對ALI大鼠模型的肺血管內(nèi)皮有保護作用，同時也維持了肺泡毛細血管屏障的完整性。而阿托伐他汀對移植EPCs有協(xié)同作用，聯(lián)合應(yīng)用將會取得更好的療效。而單獨的
3、他汀藥物治療未見明顯療效?！娟P(guān)鍵詞】內(nèi)皮祖細胞他汀類藥物急性肺損傷細胞移植急性帥損傷（ALI）及急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）是一種臨床常見的危重病，因其高致死率（高達30%-40%）⑴為當今醫(yī)學(xué)界的一個重要的問題。雖然經(jīng)過多年精心組織的臨床試驗，但是目前仍無特效的治療方法⑵。ALI/ARDS在急性滲出期（最早的24-48小時）的肺組織病理改變以中性粒細胞浸潤和肺血管內(nèi)皮的損壞為特點［3,4］o近期研究已經(jīng)證明了內(nèi)皮祖細胞（endothelialprogenitorcells,EPCs）潛在的血管內(nèi)皮再生能力。而epcs移植已經(jīng)成為治療血管損傷性疾病的
4、新策略，并收到了較好的效果［5?8］。本研究以肺血管內(nèi)皮為靶點,通過EPCs移植及促EPCs數(shù)量和活性的藥物一他汀類藥物［9>10］探討內(nèi)皮祖細胞對急性肺損傷的治療作用。材料和方法一、臍帶血內(nèi)皮祖細胞分離培養(yǎng)、鑒定和BrdU標記取足月健康新生兒臍血（經(jīng)產(chǎn)婦知情同意）,用Ficoll-Paque（天津TBD公司）離心法，分離得到臍血單個核細胞。將單個核細胞置于DMEM培養(yǎng)基中（其中添加10%胎牛血清，0?62%青霉素，1%鏈霉素，VEGF20g/l,b-FGF20g/I）,調(diào)整細胞濃度為5×106/ml,接種于包被好人纖維連接蛋白（美國R&a
5、mp;D公司）的培養(yǎng)皿中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，第4天加入BrdU（美國Sigma公司）。使培養(yǎng)液的最終濃度為10g/mLo每天在倒置顯微鏡下觀察細胞的形態(tài)變化。培養(yǎng)7天后，取貼壁細胞分別加入兔抗人vWF單克隆抗體、鼠抗人CD133單克隆抗體（美國SANTACRUZ公司），分別加入FITC標記的山羊抗兔二抗、山羊抗鼠，孵育后，熒光顯微鏡下觀察。用胰酶消化下培養(yǎng)7d的細胞，約l×106/ml個細胞沉淀中加入100微升含0.5%的PBS封閉，加入10μIPE-CD34稀釋成1：11,4°C避光孵育lOmin,PBS洗滌并重懸后,進行流式細胞儀
6、分析。二、動物分組及肺損傷模型制備SD雌性人鼠60只，體fi（200±20）g,購自人連醫(yī)科人學(xué)實驗動物中心。大鼠隨機分5組（每組12只），分別是NC組：空白對照組，LPS組：脂多糖模型組，ET組：內(nèi)皮祖細胞治療組，ST組：他汀治療組，EST組：聯(lián)合治療組。以標準飼料喂養(yǎng)，環(huán)境保持室溫25°C,相對濕度85%左右。大鼠隨機分5組（每組12只）：NC組：空白對照組，LPS組：脂多糖模型組，ET組：內(nèi)皮祖細胞治療組，ST組：他汀治療組，EST組：聯(lián)合治療組。造模前兩小吋ST組、EST組大鼠口服阿托伐他?。绹x瑞公司）20mg/kg,以后至處
7、死前每12小吋給相同劑量，其他組同時服用安慰劑。除NC組腹腔注射生理鹽水，其他各組腹腔注射脂多糖LPS（6mg/kg）造模。半小時后，ET組和EST組大鼠經(jīng)尾靜脈注入內(nèi)皮祖細胞0?2ml（約1x105/0.2ml）,其他組注射同等計量生理鹽水。48h后斷頸處死各組大鼠（研究表明：移植24h后，受體心臟發(fā)現(xiàn)24%的移植EPCs,早期EPCs移植粘附率和吋間呈正相關(guān)［ll］）o三、肺水含量的測定取右肺稱重，記錄濕重（W）,然后放入80°C恒溫烤箱中12h,取出再次稱重，記錄干重（D）,計算肺濕/干重比，即W/D,可粗略反映肺水腫程度。四、肺組織病理檢查取左
8、肺上葉，10%福爾馬林固定，石蠟包埋，HE染色，光學(xué)顯微鏡觀察并照相。病理醫(yī)師單盲讀片，肺組織
