土貝母冷浸液體外對(duì)hbsag、hbeag的抑制作用研究

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1、土貝母冷浸液體外對(duì)HBsAg、HBeAg的抑制作用研究(1遵義醫(yī)學(xué)院微牛物與免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室貴州遵義563000)(2遵義醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院口腔外科貴州遵義563000)【摘要】目的：探討土貝母冷浸液對(duì)HepG22.2.15細(xì)胞的毒性及其分泌的HBsAg、HBeAg的抑制作用。方法：采用MTT比色法觀察受試藥物對(duì)細(xì)胞的毒性，運(yùn)用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試驗(yàn)檢測(cè)藥物對(duì)細(xì)胞分泌的HBsAg和HBeAg的影響。結(jié)果：土貝母冷浸液低于32?g/mL濃度對(duì)細(xì)胞無(wú)明顯毒性作用。16?g/mL和8?g/mL的土貝母冷浸液對(duì)HepG22.2.15細(xì)胞分泌的HBsAg>HBeAg均有抑制作用，對(duì)HBe

2、Ag的作用強(qiáng)于對(duì)HBsAg的作用，抑制作用在2d時(shí)效果最好且抑制率高于陽(yáng)性藥物對(duì)照拉米夫定組，但隨著用藥時(shí)間的延長(zhǎng)抑制作用反而減弱。結(jié)論：土貝母冷浸液對(duì)HepG22.2.15細(xì)胞分泌的HBsAg、HBeAg具有抑制作用?！娟P(guān)鍵詞】乙型肝炎病毒；HepG22.2.15細(xì)胞；土貝母【中圖分類號(hào)】R96【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A【文章編號(hào)】1007-8231(2016)25-0066-02乙型肝炎病毒(HBV)是一種嚴(yán)重威脅人類健康和?；畹氖雀蜠NA病毒，據(jù)WHO報(bào)道，全世界約有1/3的人被HBV感染［1］,而慢性乙肝患者全球約有2.4億人，目前，已經(jīng)批準(zhǔn)用于治療慢性乙肝的藥物主要有兩大類：核昔(

3、酸)類似物(如拉米夫定、阿德福韋、恩替卡韋等)和干擾素類藥物［2］。但是西藥治療乙肝存在很多問題，如抗HBV沒有特效藥，藥物的不良反應(yīng)多，藥物依賴性強(qiáng)、價(jià)格昂貴等［3］。中藥土貝母為葫蘆科植物土貝母Bolbostemmapanicultum(Maxim.)Franquer的干燥塊莖，具有散結(jié)，消腫，解毒的功效［4］。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)土貝母的主要活性成分土貝母皂昔在體內(nèi)外對(duì)HBV都有一定的抑制作用［5-6］,為進(jìn)一步研究土貝母抗HBV的作用，木實(shí)驗(yàn)觀察了土貝母冷浸液體外抗HBV的作用，現(xiàn)報(bào)道如下。1?材料與方法1.1材料HepG22.2.15細(xì)胞為HBV（adw亞型）全基因轉(zhuǎn)染的人肝

4、癌細(xì)胞株、土貝母、拉米夫定（3TC）、MTT、FITC標(biāo)記的羊抗人?lgG、ELISA試劑盒、HBV?DNA熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒。1.2方法1.2.1土貝母冷浸液制備土貝母粉末（100g）,加入三蒸水（lOOOmL）,放入4°C冰箱，15d后離心收集浸出液，置恒溫磁力攪拌器上濃縮至100mL,濃度相當(dāng)于每毫升含lg生藥量，過濾除菌，分裝，置?20°C保存?zhèn)溆?。臨用前采用2%DMEM維持液配制成實(shí)驗(yàn)濃度。1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)分組用10%DMEM完全培養(yǎng)液培養(yǎng)HepG22.2.15細(xì)胞，5%CO2、37°C孵箱中培養(yǎng)。0.25%胰酶消化生長(zhǎng)狀況良好的HepG22.2.15細(xì)胞，

5、配置成1×105個(gè)細(xì)胞/mL,分別接種于96孔、24孔培養(yǎng)板中，待細(xì)胞貼壁后換含不同濃度（4、8、16、32?g/mL）土貝母冷浸液，分別培養(yǎng)2天、4天、8天。每24h換液一次，收集上清保存?20°C備測(cè)。同吋設(shè)細(xì)胞對(duì)照組及陽(yáng)性藥物拉米夫定組，空H孔不加細(xì)胞,只加培養(yǎng)液。1.2.3MTT比色法觀察藥物對(duì)細(xì)胞的毒性每孔加入10?LMTT溶液（5mg/mL）,在37°C、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育4h,棄去上清液，每孔加入150?LDMSO,振蕩器上振蕩5?lOmin,用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定每孔的光密度（OD）值，計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率二（實(shí)驗(yàn)孔OD值/對(duì)照孔OD值

6、）×100%o1.2.4ELISA法檢測(cè)HBsAg、HBeAg的量生長(zhǎng)良好的HepG22.2.15細(xì)胞以7000個(gè)/mL的濃度接種于96孔板，每孔100?Lo第二天棄去上清，實(shí)驗(yàn)組中分別加入土貝母冷浸液32、16、8?g/mL,陽(yáng)性對(duì)照3TC組50?g/mL；陰性對(duì)照組加入維持液，每孔200?L,每組6個(gè)復(fù)孔。2、4、8d收集細(xì)胞上清液于?20°C保存，按試劑盒說明書分別檢測(cè)HBsAg、HBeAgo1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù)以（x-±s）表示，應(yīng)用SPSS17.0軟件處理數(shù)據(jù)，組間比較采用單因素方差分析，P<0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2?結(jié)果2.1MTT法測(cè)定土

7、貝母冷浸液對(duì)細(xì)胞的毒性實(shí)驗(yàn)表明，在2、4、8d中，土貝母冷浸液在4?g/mL?32?g/mL濃度之間毒性隨著濃度的升高而升高，細(xì)胞存活率隨著濃度的升高而降低，高濃度組在倒置顯微鏡下可見細(xì)胞成空泡、腫脹，其至破裂。(表1)2.2土貝母冷浸液對(duì)HepG22.2.15細(xì)胞分泌的HBsAg的影響實(shí)驗(yàn)提示：隨著時(shí)間延長(zhǎng)，抑制作用減弱。(表2)(表3)3.討論中藥湯劑是液體復(fù)合分散體系，是我國(guó)應(yīng)用最早、最多的一種劑型，以水為溶劑，制作方便，價(jià)廉便宜，起效又較為迅速，在中醫(yī)臨床仍然