hbo對(duì)新生鼠缺血缺氧性腦損傷的治療效應(yīng)及作用機(jī)制研究

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1、南方醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文HBO對(duì)新生鼠缺血缺氧性腦損傷的治療效應(yīng)及作用機(jī)制研究姓名：龍琦申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：新生兒危重癥基礎(chǔ)與臨床指導(dǎo)教師：封志純20080522碩士學(xué)位論文HBO對(duì)新生鼠缺血缺氧性腦損傷的治療效應(yīng)及作用機(jī)制研究碩士研究生：龍琦指導(dǎo)教師：封志純教授摘要目的1、判斷高壓氧(HBO)是否對(duì)缺血缺氧性腦損傷新生大鼠具有治療作用；2、觀察HBO對(duì)于缺氧缺血性腦損傷新生大鼠內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的影響；3、探討HBO治療的具體作用機(jī)制，為探索治療新生兒缺氧缺血性腦病(HIE)的有效方法提供科學(xué)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)和新的思路。方法將新生7日齡SD大鼠

2、120只隨機(jī)分成3組，分別為假手術(shù)組(sham)(n=40)、缺氧缺血性模型組(contr01)(n=40)、HBO治療組(trial)(n=40)。采用經(jīng)典的Rice法制成HIBD模型，SD大鼠經(jīng)乙醚麻醉后仰臥固定于手術(shù)臺(tái)上，頸部常規(guī)消毒，做頸部正中切口游離左側(cè)頸總動(dòng)脈并雙線結(jié)扎，剪斷線結(jié)之間的血管，縫合皮下及皮膚。縫合皮膚后，立即置于8％氧濃度、艙溫(36士1℃)的自制常壓缺氧艙中，持續(xù)2小時(shí)后出艙。造模過程中密切觀察SD大鼠神經(jīng)系統(tǒng)的異常改變并進(jìn)行神經(jīng)功能缺陷評(píng)分，將神經(jīng)功能缺陷評(píng)分為1．3分者納入實(shí)驗(yàn)。sham組切開皮膚后，僅分離右側(cè)

3、頸總動(dòng)脈，不結(jié)扎也不進(jìn)行缺氧及注射藥物等處理：control組在造膜成功后，不再做其他處理；trial組在造模成功后即給予高壓氧治療(勻速升壓10min，使艙內(nèi)壓力達(dá)0．2Mpa后排氣，保持艙內(nèi)壓力及氧濃度恒定，穩(wěn)壓20min后關(guān)閉進(jìn)氣閥，勻速降壓10min至常壓出艙，最長(zhǎng)治療時(shí)間5天，每天1次，最多治療5天)。于缺血缺氧后7天、14天和21天中文摘要各處死10只，灌注固定后，根據(jù)大鼠腦立體定位圖譜，將固定的鼠腦從前囟后以視交叉為中心，前后2"--6mm行冠狀面冰凍切片。選取10"-209in的冰凍切片切片進(jìn)行HE染色，60pxn的冰凍切片進(jìn)

4、行免疫組化染色；分別觀察腦組織病理改變，以及腦海馬區(qū)和腦感覺運(yùn)動(dòng)皮層區(qū)nestin蛋白的陽(yáng)性表達(dá)情況。剩余的30只大鼠繼續(xù)喂養(yǎng)，以大鼠37"--41日齡的學(xué)習(xí)記憶功能(morris水迷宮實(shí)驗(yàn))、大鼠42日齡的腦組織形態(tài)學(xué)改變和大鼠42日齡神經(jīng)元的機(jī)能狀態(tài)(nissl實(shí)驗(yàn))來判斷干預(yù)效果。結(jié)果l、HE染色：sham組海馬各部組織結(jié)構(gòu)正常，可見有3．4層椎體細(xì)胞，排列整齊緊密，高倍鏡下可見這些神經(jīng)元核大而園，透明，有1．2個(gè)明顯的核仁。control組術(shù)后7天可見椎體細(xì)胞溶解，突起斷裂、變短或消失，輪廓模糊，雄體細(xì)胞減少，海馬CAl區(qū)椎體細(xì)胞排列

5、散亂，周圍膠質(zhì)細(xì)胞增生明顯；術(shù)后14天及21天相似，表現(xiàn)為椎體細(xì)胞排列紊亂、疏松，層次不清，細(xì)胞間隙增大，神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞嚴(yán)重皺縮、深染，核縮小呈梭形及三角形，核仁不清，僅殘留部分正常神經(jīng)元。trial組術(shù)后7天可見大量的椎體細(xì)胞溶解，突起斷裂，變短或消失，輪廓模糊，椎體細(xì)胞減少，海馬CAI區(qū)椎體細(xì)胞排列散亂；術(shù)后14天及21天相似，表現(xiàn)為椎體細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞胞漿豐富，核仁清楚，但椎體細(xì)胞層較假手術(shù)組左側(cè)薄。2、nestin蛋白免疫組化染色陽(yáng)性表達(dá)在腦不同部位的檢測(cè)：兩個(gè)不同部位的計(jì)數(shù)均以缺氧缺血后第7天trial組的nestin陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)

6、目最高，14天后nestin表達(dá)開始下降，21天仍有表達(dá)。各組的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)用平均數(shù)4-標(biāo)準(zhǔn)差表示，各實(shí)驗(yàn)組均數(shù)間的比較采用析因設(shè)計(jì)資料方差分析，a=0．05為顯著性檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。3組大鼠不同處死時(shí)間點(diǎn)大鼠腦海馬區(qū)Nestin陽(yáng)性細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察：sham組：nestin陽(yáng)性表達(dá)的神經(jīng)前體細(xì)胞染色偏淡，胞體突起不明顯。control組和trial組：陽(yáng)性表達(dá)的神經(jīng)前體細(xì)胞呈明顯的區(qū)域性分布，胞漿呈棕黃色，染色較深，胞體突起明顯，胞核呈空泡狀。主要分布在海馬區(qū)的分子層、椎體細(xì)胞層和內(nèi)n碩士學(xué)位論文顆粒細(xì)胞層。不同時(shí)間點(diǎn)nestin陽(yáng)性細(xì)胞在分布區(qū)域、

7、形態(tài)以及生長(zhǎng)方式等方面存在一定的差異。3組大鼠不同處死時(shí)間點(diǎn)左側(cè)大腦海馬區(qū)Nestin陽(yáng)性細(xì)胞檢出率比較：使用析因設(shè)計(jì)資料的方差分析，結(jié)果顯示組間差異有顯著性(F=342．677，P<0．001)，各實(shí)驗(yàn)組每一時(shí)間點(diǎn)的nestin陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目從多到少分別為trial組>control組>sham組。不同時(shí)間點(diǎn)間差異也有顯著性(F=185．654，P<0．001)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，nestin陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)大體呈下降趨勢(shì)。實(shí)驗(yàn)組與時(shí)間之間存在交互作用(F--72．167，P<0．001)，提示各實(shí)驗(yàn)組nestin陽(yáng)性細(xì)胞檢出率的變化隨時(shí)間的增加而具

8、有不同的變化趨勢(shì)。進(jìn)一步分析單獨(dú)效應(yīng)，結(jié)果顯示各時(shí)間點(diǎn)內(nèi)兩組間比較均有顯著性差異(P