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《胃癌病理特征與hif-1α和vegf+mrna表達(dá)水平的關(guān)系》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫(kù)。
1、萬(wàn)方數(shù)據(jù)山東大學(xué)碩士學(xué)位論文材料與方法一、實(shí)驗(yàn)材料1、組織來(lái)源我們選擇2014—2015年在單縣中心醫(yī)院普通外科三病區(qū)接受手術(shù)治療的67例胃癌病人，該67例病人均經(jīng)術(shù)后病理確診為胃癌，并進(jìn)行分期，患者術(shù)前全部行胃鏡取活組織病理(所有患者己知情同意，并經(jīng)倫理委員會(huì)批準(zhǔn))。在胃鏡檢查中，每個(gè)病人分別至少取胃癌組織及周圍正常粘膜組織(距腫瘤邊緣大于5cm6塊進(jìn)行活檢，取其中4塊液氮保存以備RNA提取和RT—PCR之用。余組織保存于4％多聚甲醛以備病理檢查。2、主要試劑Taq酶NEB公司DNAMarkerTakara公司1KPIUsDNAlader天根生化
2、科技有限公司dNTP生工生物工程公司胰酶HYCIOne公司CDNA第一鏈合成試劑盒GibiCOl公司TRIZOInVitrogen公司3、生化試劑生化基礎(chǔ)試劑如氯化鈉、EB、氯仿均由實(shí)驗(yàn)室提供。PCR引物合成、測(cè)序均由Takara公司完成。4、實(shí)驗(yàn)儀器穩(wěn)壓電泳儀上海西巴斯PCR儀美國(guó)賽默飛世爾公司熒光顯微鏡及照相系統(tǒng)日本OIymPUS公司低溫高速離心機(jī)日立公司二、實(shí)驗(yàn)方法萬(wàn)方數(shù)據(jù)山東大學(xué)碩士學(xué)位論文(一)主要溶液配制1、5xTBE取Tris堿549，硼酸27．59，EDTA4．659，加水溶解至1L。2、1％瓊脂糖凝膠取瓊脂粉19，加入TBE至10
3、0mL，微波爐內(nèi)高溫溶解，待溫度降低至50。C以下加入O．5pg／mLEB20pL混勻后倒入板中。(二)總RNA提取1、組織勻漿：(1)取出經(jīng)高壓鍋高壓蒸汽滅菌的研缽，將此前存放于液氮內(nèi)的組織切60mg放入上述容器內(nèi)，并置入少量液態(tài)氮?dú)?，將冰凍組織研碎。(2)每份均漿組織標(biāo)本中加入1mlTRIZOL。(3)上述標(biāo)本即為勻漿組織，置入小的eppendorf管內(nèi)，于設(shè)置為20。C的恒溫箱內(nèi)靜置5分鐘。2、相分離：在上述勻漿液內(nèi)加入氯仿，蓋嚴(yán)后在振蕩器內(nèi)震蕩15秒，常溫放置2分鐘，取離心力120009，在冷凍離心機(jī)內(nèi)，2。C離心15分鐘。離心后分成三層。
4、RNA即存在于水相中。3、沉淀RNA：上層呈現(xiàn)水相，將其水相轉(zhuǎn)移到另一管中，加入異丙醇002ml，昌常溫靜置10分鐘，將EP管以上步驟離心環(huán)境離心10min。4、RNA洗滌：離心后，將上清液小心吸出，EP管內(nèi)加入75％酒精1mI洗滌沉淀，將EP管租入振蕩器并混勻，同上步驟離心。5、RNA再溶解：離心后，將上清液小心吸出，常溫放置10min，干燥沉淀物沉淀物即為RNA。取溶解用水20pl，并用微量移液器反復(fù)吹打多次，混勻沉淀，放置于恒溫箱內(nèi)，設(shè)置溫度為60℃，放置10分鐘。6、測(cè)濃度：取21J!儲(chǔ)存液加入另一個(gè)EP管中，再加入981JI無(wú)RNase水
5、，離心混勻，以無(wú)RNase水作空白對(duì)照，測(cè)OD260／280值。1OD=401JgRNA。OD260／280值在1．8．2．0視為合格樣品。(三)引物引物序列如表1，引物合成及測(cè)序均由Takatra公司完成。萬(wàn)方數(shù)據(jù)山東大學(xué)碩士學(xué)位論文引物序列玨【F—la上游下游VEGF．J上游下游GA糾D匱p上游下游5’．()四GCACTcA艘cAAGAAGTTGC．3’5．．rI℃餓CTC聊T。I’{GG％AGG∞’5LGCAG從麟TCA鼢AGTGG．3’5’戈CAAoG泓GW掰G訂掰G-3’5’-AACGGATITGGTcGTA玎GGG．3’5’一ToGCI
6、℃C％G從∞GGT∞3’(四)第一鏈CDNA合成1、根據(jù)純度計(jì)算，將微量離心管內(nèi)放入5I】g的RNA混懸液，補(bǔ)充DEPC水，使反應(yīng)體系達(dá)到11IjI。在管中加10pMOligo(dT)12—181IJI，輕輕混勻、離心；2、70℃加熱10min，立即將微量離心管插入冰浴中至少1min；然后加入下列試劑的混合物：10xPCRbuffer2pl；25mMMgCl22UI；10mMdNTPmixpl；0．1MDTT2pl。予以輕輕混勻，離心。42。C孵育5min，3、加入SuperscriptIT1Ijl，在42。C水浴中孵育50min；4、于70℃加熱
7、15min以終止反應(yīng)；5、將管插入冰中，加入RNaseH1IJI，37。C孵育20min，降解殘留的RNA。一20℃保存?zhèn)溆谩?五)PCR反應(yīng)1、取0．5mlPCR管，依次加入下列試劑：第一鏈cDNA2IJI；上游引物(10pM)2pl；下游引物(10pM)2IJI；dNTP(2mM)4pl；10xPCRbuffer5pl；Taq酶(2u／IJI)1UI。2、加入適量的ddH20，使總體積達(dá)50lJI。輕輕混勻，離心；3、PCR反應(yīng)程序如下：萬(wàn)方數(shù)據(jù)山東大學(xué)碩士學(xué)位論文94vC5mln：94℃，30s、l60。C，30sL30cycles72℃，1
8、min—J72℃，15min；4℃保存。4、電泳鑒定：取產(chǎn)物5pL，將上述產(chǎn)物6xLoadingBuffer5pL仔細(xì)用移
