hif1α促進內(nèi)皮祖細胞血管新生的實驗的研究

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1、上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院博士學(xué)位論文HlF-1oc促進內(nèi)皮祖細胞血管新生的實驗研究摘要內(nèi)皮祖細胞(endothelialprogenitorcell，EPC)是血管內(nèi)皮細胞的前體細胞，在胚胎或成年后缺血、創(chuàng)傷等病理狀態(tài)下參與血管的新生。1997年Asahara等在Science上發(fā)表的文章提出：人外周血中分離得到的EPC在體外培養(yǎng)可分化為內(nèi)皮細胞并表達內(nèi)皮特異性成分，在裸鼠下肢缺血模型中EPC可參與新生血管的形成，這一發(fā)現(xiàn)為缺血性疾病提供了新的輔助治療手段，此后，國際上對于外周血EPc移植促血管新生的研究始終方興未艾。但是由于循環(huán)血中EPC數(shù)量不足，限制了EPC的廣泛應(yīng)用。

2、因此，如何通過各種措施增加EPC數(shù)量已經(jīng)成為目前研究的焦點。低氧誘導(dǎo)因子一la(Hypoxiainduciblefactor-la，HIF-Icc)是在低氧環(huán)境中起細胞調(diào)控作用的關(guān)鍵基因，在缺血造成的低氧中發(fā)揮重要作用，但HIF-la與干細胞尤其是EPC的關(guān)系尚不清楚。本研究試圖探討HIF-let轉(zhuǎn)染到EPC后的變化，HIF-Ia在EPC中的過表達是否有助于進一步促進EPC的血管新生作用，為EPC在促進血管新生和治療缺血性疾病的臨床應(yīng)用方面提供理論基礎(chǔ)和新的實驗依據(jù)。第一部分H瑾．1蔭染EPC的初步探討【目的】建立人外周血內(nèi)皮祖細胞(EPC)體外培養(yǎng)、誘導(dǎo)分化方上海交

3、通大學(xué)醫(yī)學(xué)院博士學(xué)位論文法，觀察電穿孔轉(zhuǎn)染HIF-ltx至EPC后，EPC在體外向內(nèi)皮細胞(endothefialcell，EC)分化的性質(zhì)、擴增及遷移功能改變及對體內(nèi)缺血下肢血管新生的影響?！痉椒?密度梯度離心法分離獲得人外周血單個核細胞，體外通過血管內(nèi)皮生長因子(vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)、成纖維細胞生長因子誘導(dǎo)、分化、擴增EPC并鑒定。分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建HIF-Ia特異性干擾質(zhì)粒(si瑚R1a)，電穿孔技術(shù)轉(zhuǎn)染HIF-la或其干擾質(zhì)粒，觀察基因修飾的EPC形態(tài)學(xué)及功能學(xué)改變?！窘Y(jié)果】體外培養(yǎng)所的EPC7天后CD34

4、+約30％，ACl33+約10％，CD31+約33％，細胞保持EC前體細胞特性并可定向向EC分化；EPC內(nèi)的HIF-lctmRNA在常氧及低氧下有表達，但其蛋白表達在常氧中不穩(wěn)定。電穿孔轉(zhuǎn)染GFP空質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率約25％，低氧環(huán)境中轉(zhuǎn)染HIF-1tx后的EPC中HIF-10c、VEGFmRNA及蛋白表達升高，可被特異性siHIF-la中度抑制；功能學(xué)檢測示HIF．1et過表達增加了EPC在體外的分化、擴增、遷移；EC標(biāo)記物CD31、VEGFR2、eNOS及VEGF、NO分泌增Dl：h移植HIF-1a-EPC至缺血下肢后可見外源性EPC存在于缺血部位；HⅡ'-l0【．E

5、PC較對照組進一步促進體內(nèi)毛細血管數(shù)目增加?！窘Y(jié)論】在體外，HIF-IⅨ修飾的EPC不影響其前體細胞性質(zhì)，可促進EPC擴增及遷移功能改善；在體內(nèi)，HIF．1ct-EPC有助于促進缺血下肢的局部血管新生。Ⅱ上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院博士學(xué)位論文第二部分腺病毒介導(dǎo)HtF-lo：體夕卜感染EPC的實驗研究【目的】改進轉(zhuǎn)染方法，通過腺病毒介導(dǎo)HIF-la至EPC，提高了感染效率，觀察腺病毒介導(dǎo)的HIF-lct在EPC中的過表達是否在體外有利于促進EPC的成血管活性?！痉椒ā吭隗w外構(gòu)建人HIF-la基因腺病毒載體(Ad．HIF-lct)及其siRNA抑制載體(Ad．siHIF．1∞；通

6、過腺病毒介導(dǎo)人HIF-lct基因(Ad．HIF-1∞入EPC，觀察感染后EPC在體外的擴增及遷移功能改變?！窘Y(jié)果】以MoI為70感染各組細胞6h后，熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率80％以上并持續(xù)至少1月，未發(fā)現(xiàn)明顯的腺病毒感染引起的凋亡；感染Ad-HIF-10【后的EPC在體外細胞擴增數(shù)成倍增加，遷移功能改善(P<0．05)，感染Ad．siHIF-lct后的EPC擴增及遷移功能受抑制。疇§論】在體外，通過腺病毒介導(dǎo)的方法基因修飾EPC初步認為高效，細胞損傷小。體外Ad．HIF-IIx感染EPC增加了EPC的成血管活性，為進一步在體內(nèi)實驗奠定了基礎(chǔ)。第三部分Ad．HIF-lt)

7、【-EPC對裸鼠缺血下肢血管新生的影響【目的】觀察腺病毒介導(dǎo)的HIF-la在EPC中的過表達在體內(nèi)是否有利于促進下肢局部缺血的恢復(fù)。【方法】實驗性下肢缺血的裸鼠造模，術(shù)后7天觀察造模是否成功；在體外通過腺病毒感染的方法介導(dǎo)人HIF-lct基因(Ad．HIF-lC0入EPC，經(jīng)尾靜脈將Ad．陽Blo卜EPC注入實驗性下肢缺血的裸鼠；基因及蛋白水平觀察HIF-ltx的轉(zhuǎn)入；28天后大體標(biāo)本觀察缺血下肢的m上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院博士學(xué)位論文恢復(fù)情況；毛細血管計數(shù)；T]陀法觀察缺血面積；局部溫度測定及下肢多普勒血流測定?！窘Y(jié)果】裸鼠左下肢股動脈部分結(jié)扎切除術(shù)后7