極細(xì)鏈格孢菌功能基因his3及l(fā)eu2的初步研究

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1、捅要極細(xì)鏈格孢菌(Alternariatenuissima)是一種植物病原真菌，對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)危害巨大，然而其在生防、環(huán)保等方面也有應(yīng)用，因此從分子水平研究該菌的功能基因的調(diào)控機(jī)制，對(duì)進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用該菌具有重要意義。在真核微生物的遺傳學(xué)研究中LEU2和HIS3基因是重要的營(yíng)養(yǎng)標(biāo)記，通過(guò)遺傳學(xué)手段，我們篩選獲得了極細(xì)鏈格孢菌AtLEU22量．AtHIS3基因，并且研究了AtLEU2’)及-AtHIS3基因互補(bǔ)釀酒酵母的功能。以(3418抗性基因作為選擇標(biāo)記，構(gòu)建了用于敲除極細(xì)鏈格孢菌彳圮E叩勵(lì)tHIS3基因的質(zhì)粒，建立了極細(xì)鏈格孢菌的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，為進(jìn)一步研

2、御圮E沈黝tHIS3基因的功能奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，主要研究結(jié)果如下：1、將極細(xì)鏈格孢菌eDNA表達(dá)文庫(kù)轉(zhuǎn)化到酵母LEU2缺失突變株，用SD．LEU培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，獲得了3個(gè)正常生長(zhǎng)的酵母轉(zhuǎn)化子。對(duì)轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)這些基因編碼的蛋白質(zhì)序列均與酵母LEU2(&皿沈)基因編碼的363個(gè)氨基酸同源(命名為AtLEU2，其編碼的蛋白質(zhì)命名為Atleu2p)，該基因編碼的蛋白與植物病原菌小麥穎枯病CAB72262；灰葡萄孢霉EDN21270；玉蜀黍赤XP一386851，以及水稻稻瘟病病菌XP367617所編碼的p．蘋果酸脫氫酶同源，相似性分別達(dá)到94％、

3、74％、1％和69％，與釀酒酵母、粗糙鏈孢霉EAA33847相似性為70％和63％。2、將極細(xì)鏈格孢菌eDNA表達(dá)文庫(kù)轉(zhuǎn)化到酵母HIS3缺失突變株，在SD．HIS培養(yǎng)基上篩選，獲得了2個(gè)正常生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)化子。所得基因的開(kāi)放閱讀框(ORF)含有717個(gè)堿基，編碼238個(gè)氨基酸，與酵母HIS3(ScHIS3)基因同源(命名為AtHIS3，其編碼的蛋白質(zhì)命名為AtHis3p)，AtHis3p與植物病原真菌鏈格孢BAF69039，小麥穎枯病EAT83561，灰葡萄孢霉EDN23196，玉蜀黍赤霉XP386269，以及水稻稻瘟病病菌XP367617中編碼的咪唑甘油磷

4、酸脫水酶同源，相似性分別達(dá)到100％，90％，68％，65％和63％；與生防菌哈茨木霉P34041相似性達(dá)64％；與釀酒酵母，粗糙鏈孢霉XP961386編碼的蛋白相似性達(dá)64％和66％。3、分別選擇以AtLEU2及AtHIS3基因上下游同源序列500bp左右作為同源臂，在上游同源序列3’端連接G418抗性基因(以保證缺失突變株的檢測(cè)及鑒定)，構(gòu)建了用于敲除極細(xì)鏈格孢菌AtLEU2及AtHIS3基因的質(zhì)粒，為在極細(xì)鏈格孢菌中敲除AtLEU2及AtHIS3基因奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，為進(jìn)一步研究鏈格孢菌AtLEU2及AtHIS3基因的功能及作用機(jī)理提供了重要的試

5、驗(yàn)材料。4、基于極繃鏈格孢蘸在含有G418(100l-tg／mL)的PDA培養(yǎng)基上不能生長(zhǎng)的藥物敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果，建立了用G418抗性基因作為選擇標(biāo)記的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，從而為研究極細(xì)鏈格孢菌功能基因的敲除、缺失突變株鑒定提供了可靠的篩選標(biāo)記，并為后續(xù)研究打下必要的基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞：極細(xì)鏈格孢菌，eDNA表達(dá)文庫(kù)，AtLEU2基因，AtHIS3基因，原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化ⅡIdentif!icationandPremilinaryStudyofHIS3andLEU2genesofthefungusAlternariatenuissimaW撕Ying(PlantPathol

6、ogy,SichuanAgriculturalUniversity)DirectedbyHuangYunandJingLing-huoAbstractAlternariatenuissimaisaplantpathogenicfungi，ithasenormousharminagriculture，butalsousedinbiologicalcontrol，environmentalprotection,andSOon．ItisimportanttostudytheregulatorymechanismoffunctionalgeneinAltern

7、ariatenuissima．InEukaryotiemicroorganisms，LEU2andHIS3genesisallimportantmarkerofnutrition．Inthisstudy，wescreenedtheAlternariatenuissimaeDNAexpressionlibraryinauxotrophyeast,andidentifiedandcharacterizedtheA．tenuissimaAtLEU2andAtHIS3genes．ArecombinantvectorsforknockingoutAtLEU2an

8、dAtHIS3geneswasconstructed，andinsertedtheG418re