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《萊菔硫烷對(duì)ⅱ相酶的誘導(dǎo)及其與核轉(zhuǎn)錄因子nrf1、nrf2、nrf3關(guān)系的研究》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫(kù)。
1、中文摘要萊菔硫烷對(duì)Ⅱ相酶的誘導(dǎo)及其與核轉(zhuǎn)錄因子Nrfl、Nrf2、Nrf3關(guān)系的研究摘要氧化應(yīng)激在許多疾病的病因?qū)W中占有重要地位，機(jī)體產(chǎn)生有效的反應(yīng)來(lái)對(duì)抗內(nèi)源性或外源性氧化劑帶來(lái)的一系列威脅，這對(duì)于維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)和生存至關(guān)重要。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，轉(zhuǎn)錄因子核因子紅系2相關(guān)因子2(Nrf2)在星形膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的保護(hù)神經(jīng)元、對(duì)抗氧化應(yīng)激反應(yīng)中起著舉足輕重的作用。Nr億促進(jìn)含抗氧化反應(yīng)元件(觸迮)啟動(dòng)子序列的抗氧化基因的轉(zhuǎn)錄，這些基因包括谷氨酸半胱氨酸連接酶催化和調(diào)節(jié)亞單位(Gclc、Gclm)，谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶同工酶類(GST)，NAD(P)H：醌氧化還原酶1
2、(Nq01)，血紅素氧化酶1(H01)。Nrf2屬于CNC(cap—ncollar)堿性亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)(bZIP)家族的轉(zhuǎn)錄因子，CNC家族還包括Nrfl和Nrf3。Nrfl和Nrf2正向調(diào)節(jié)ARE介導(dǎo)的基因表達(dá)，而c．Fos和Fral負(fù)向調(diào)節(jié)這一表達(dá)過(guò)程。萊菔硫烷(sulforaphane，SFN)自1992年被發(fā)現(xiàn)具有化學(xué)保護(hù)作用以來(lái)，逐漸成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。SFN具有抗腫瘤、抗氧化損傷、免疫調(diào)節(jié)、抗菌等藥理作用，SFN通過(guò)分裂Nrf2．Keapl之間的連接誘導(dǎo)II相酶，McWalter等用SFN喂養(yǎng)Nrf2敲除小鼠7d后仍然在胃、小腸、肝臟中發(fā)現(xiàn)
3、Nqol、GSTAl／2、GSTA3和GSTMl／2表達(dá)增加，雖不能與正常組比較，但說(shuō)明可能還有另外的機(jī)制在起作用。有人認(rèn)為Nrf3負(fù)相調(diào)節(jié)ARE介導(dǎo)的基因表達(dá)，具有一定的生理功能。因此，本實(shí)驗(yàn)欲利用萊菔硫烷干預(yù)Nr也+／+，Nrf2．／-,J,鼠培養(yǎng)的原代星形膠質(zhì)細(xì)胞模型探討II相酶誘導(dǎo)與核轉(zhuǎn)錄因子Nrfl、Nrf2、Nrf3之間的關(guān)系。第一部分原代星形膠質(zhì)細(xì)胞模型的建立目的：體外培養(yǎng)小鼠原代星形膠質(zhì)細(xì)胞。方法：1原代星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)：將Nrf2+／+、Nrf2．／．新生乳鼠消毒、斷頭，取出大腦皮層，放于D．Hank’S液中，解剖顯微鏡下剝離腦膜。將組
4、織剪中文摘要碎，胰蛋白酶消化，終止后離心，棄去上清液，重懸后將細(xì)胞懸液接種至25cm2玻璃培養(yǎng)瓶底，放于37℃，5％C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24．36小時(shí)后換液，以后每4．5天換液一次，倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況。2原代星形膠質(zhì)細(xì)胞的純化及鑒定：將90％以上融合的星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)瓶置于恒溫培養(yǎng)搖床，37"C，200轉(zhuǎn)／分鐘，連續(xù)搖動(dòng)3小時(shí)后更換培養(yǎng)液，放入C02培養(yǎng)箱中。用胰酶消化后，接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，待細(xì)胞長(zhǎng)滿后取出，多聚甲醛固定，打孔，馬血清封閉；加入抗GFAP小鼠單克隆抗體，4。C搖床過(guò)夜。次日避光加入CY5標(biāo)記的抗小鼠熒光二抗和Hoch
5、est染料，撈出小玻片用抗熒光衰減封片劑封片，激光共聚焦顯微鏡觀察，照相。結(jié)果：細(xì)胞的生長(zhǎng)情況及鑒定：大腦皮層細(xì)胞培養(yǎng)約4-6小時(shí)后貼壁生長(zhǎng)，為圓點(diǎn)狀帶有突起。24．48小時(shí)后細(xì)胞變大，突起變長(zhǎng)，有少數(shù)細(xì)胞相互融合成片狀。12．14天后細(xì)胞約占95％以上，分為兩層，底層為片狀彼此融合的星形膠質(zhì)細(xì)胞，細(xì)胞體積較大，胞質(zhì)豐富，核偏位，突起較多較長(zhǎng)，相互交聯(lián)呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，細(xì)胞彼此界限不明顯，上層為亮點(diǎn)狀小膠質(zhì)細(xì)胞，細(xì)胞體積小，胞質(zhì)含量少，突起細(xì)長(zhǎng)，細(xì)胞間界限明顯。經(jīng)搖床純化后，可見上層細(xì)胞脫落，細(xì)胞種類更為單一。星形膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)記物GFAP染色，95％以上為陽(yáng)性
6、細(xì)胞。結(jié)論：培養(yǎng)出的細(xì)胞為原代星形膠質(zhì)細(xì)胞，純度達(dá)95％以上，該細(xì)胞可用于體外II相酶誘導(dǎo)與核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2依賴關(guān)系的研究。第二部分萊菔硫烷對(duì)Ⅱ相酶的誘導(dǎo)及其與核轉(zhuǎn)錄因子Nrfl、Nrf2、Nrf3關(guān)系的研究目的：觀察萊菔硫烷對(duì)原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞II相酶誘導(dǎo)情況，以及II相酶誘導(dǎo)與核轉(zhuǎn)錄因子Nrfl、Nr￡2、Nrf3的關(guān)系。方法：lN咆+／+、Nrf2．／．轉(zhuǎn)基因小鼠的鑒定：提取Nrf2+／+、№．f2-／-小鼠尾尖DNA，分別以Nr也+／+、Nrf2-／．引物PCR擴(kuò)增目的基因，擴(kuò)增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳鑒定。2實(shí)驗(yàn)分組及收集細(xì)胞：細(xì)胞分為兩組，
7、即Nrf2+／+和Nrf2．／一組，每2中文摘要組又分為溶劑對(duì)照組和藥物干預(yù)組。首先給予Nr也+／+組不同濃度的萊菔硫烷，即DMSO、2．5umol／1、5umol／1、10umol／1、15umol／1，通過(guò)測(cè)定II相酶的表達(dá)來(lái)選擇最佳給藥濃度。然后分別給予Nr億+／+、Nrf2．／-組DMSO和最適濃度的萊菔硫烷，24小時(shí)后棄去培養(yǎng)液，收集細(xì)胞，儲(chǔ)存于一80。C冰箱。．3II相酶表達(dá)水平測(cè)定：用裂解液裂解細(xì)胞，BCA法測(cè)定蛋白濃度，每個(gè)樣品按201xg蛋白上樣，10％SDS．PAGE電泳后轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，封閉后經(jīng)兔抗Gclc抗體(1：500)、兔抗
8、Hol抗體(1：500)、兔抗Gclm抗體(1：200)、羊抗Nqol抗體(1：
