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《amh對豬卵泡膜細胞類固醇激素合成酶的影響極其機制研究》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學術(shù)論文-天天文庫。
1、本項研究受下列基金資助1.安徽農(nóng)業(yè)大學“學科骨干培育計劃”2.安徽省自然科學基金（1408085MKL40）3.安徽省科技攻關(guān)項目（1301032157）SUPPORTEDBY1.FoundationforDisciplineKeyScholarsofAnhuiAgriculturalUniversity2.NaturalScienceFoundationofAnhuiProvince(1408085MKL40)3.KeyTechnologiesR&DProgramofAnhuiProvince(1301032157)萬方數(shù)據(jù)摘要
2、抗繆勒氏管激素（anti-müllerianhormone，AMH）是轉(zhuǎn)化生長因子β（transforminggrowthfactor，TGF-β）超家族成員之一，由生長卵泡中的顆粒細胞分泌，能夠抑制原始卵泡的募集和降低生長卵泡對促卵泡素的敏感性，但其作用機制尚不清楚。豬是醫(yī)學試驗上理想的動物模型，為了深入探討AMH在對豬卵泡膜細胞在類固醇合成上的作用，開展了如下實驗：試驗一：AMH在豬上的表達模式本試驗主要采用RT-qPCR技術(shù)，分析了AMH及AMHR在豬不同組織器官上以及在不同卵泡直徑上的表達規(guī)律；利用ELISA技術(shù)，分析了在
3、不同直徑卵泡液中AMH的表達規(guī)律。試驗結(jié)果表明：AMH及AMHR2在豬睪丸和卵巢中高表達，而在其它組織中不表達或表達量極低。顆粒細胞中AMHmRNA水平和卵泡中蛋白水平均呈現(xiàn)隨著卵泡直徑的增大，AMH的表達量逐漸降低；在大卵泡（＞5mm）顆粒細胞中，AMHR2表達量最高（P<0.05），而小卵泡及中卵泡（直徑1-5mm）的顆粒細胞中AMHR2的表達量最低，且無明顯差異（P＞0.05）。這說明，AMH及AMHR2的表達量與卵泡的生長發(fā)育階段有關(guān)。試驗二：豬卵巢卵泡膜細胞的分離純化和培養(yǎng)采用三種方法進行了豬卵泡膜細胞的優(yōu)化，方法A：注
4、射針頭刮去顆粒細胞層，方法B：手術(shù)剪碎膜細胞層。A和B法均用IV型膠原酶消化后percoll密度梯度離心獲取44%和35%中間層為膜細胞，C法直接將膜細胞層用IV型膠原酶消化后采用兩次percoll梯度離心獲取卵泡膜細胞。利用波形蛋白、角蛋白、因子Ⅷ三種蛋白的抗體進行細胞免疫熒光染色鑒定和流式細胞術(shù)鑒定細胞純度。結(jié)果表明：方法A獲得的膜細胞存活率及純度均顯著高于方法B和C（92.00%vs.80.33%,85.00%；95.77%vs.87.87%,90.87%）（P<0.05）；方法B獲得的細胞數(shù)顯著高于777方法A和C（1.0
5、6×10vs.0.74×10,0.86×10）（P<0.05），但耗時顯著低于方法A和C（236.67minvs.260.00min，268.33min）（P<0.05）。結(jié)論：方法A可獲得較高膜細胞純度和細胞活力，本實驗為進一步研究膜細胞的功能提供了基礎。試驗三：AMH對卵泡膜細胞上類固醇激素合成酶的影響及機制研究FSH和AMH單獨或是共同添加于卵泡膜細胞中48h后，通過Real-timeqPCR發(fā)現(xiàn)：在豬卵泡膜細胞中，F(xiàn)SH和AMH無論是單獨作用還是聯(lián)合作用，對LHCGR、STAR、CYP11A1、CYP17A1以及3β-HS
6、D的表達均無顯著影響（P＞0.05），但FSH或AMH單獨作用能夠顯著提高STARmRNA的表達（P＜0.05），F(xiàn)SH和AMH共同作用對STARmRNA的表達水平無顯著影響（P＞0.05）。這表明，F(xiàn)SH和AMH在促進類固醇合成起始過程中可能存在協(xié)同作用。LH和AMH單獨或共同添加于卵泡膜細胞中48h后，通過Real-timeqPCR發(fā)I萬方數(shù)據(jù)現(xiàn)：在豬卵泡膜細胞中，LH單獨作用能夠誘導LHCGR、CYP11A1、CYP17A1以及3β-HSDmRNA表達水平上調(diào)（P＜0.05）；AMH單獨作用對LHCGR、STAR、CYP11
7、A1、CYP17A1以及3β-HSDmRNA表達水平無顯著影響（P＞0.05）；LH和AMH聯(lián)合作用時，LHCGR、CYP17A1、3β-HSDmRNA表達水平與對照組及AMH單獨作用組均無顯著差異（P＞0.05），但顯著低于LH單獨作用組的水平（P＜0.05），而對STAR、CYP11A1mRNA表達水平無顯著影響（P＞0.05）。Forskolin和AMH單獨或共同添加于卵泡膜細胞中48h后，通過Real-timeqPCR發(fā)現(xiàn)，在豬卵泡膜細胞中，F(xiàn)orskolin能夠顯著上調(diào)LHCGR、CYP11A1、CYP17A1以及3β-
8、HSDmRNA的水平（P＜0.05）；Forskolin和AMH共同作用也可上調(diào)LHCGR、CYP11A1、CYP17A1以及3β-HSDmRNA表達水平，且與Forskolin單獨作用無顯著差異。這表明，在豬卵泡膜細胞上，AMH并不是以cAMP作
