hif1α和vegf在胃癌中的表達(dá)與臨床意義

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1、溫州醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文擇手術(shù)方式提供有價值依據(jù)，而且有助于臨床抗腫瘤治療提供新思路、開辟新的途徑，為阻斷腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移治療提供新的靶點。溫州醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文材料和方法一．實驗設(shè)計本研究采用免疫組化SP法檢測60例胃癌組織以及20例胃潰瘍組織、20例正常胃組織中的HIF一1a與與VEGF蛋白的表達(dá)。二．標(biāo)本采集從1996—2000年我院收治的401例胃癌病例中選取60例術(shù)前未經(jīng)過放療、化療并具有完整的l臨床病理資料和回顧性隨訪資料的胃癌術(shù)后石蠟標(biāo)本(惡性組)作為研究組。以及同時期手術(shù)的胃潰瘍標(biāo)本(良性組)20例、正常胃粘

2、膜組織標(biāo)本(正常組)20ff0(為同批次胃潰瘍的手術(shù)標(biāo)本周邊的『F常胃粘膜組織)設(shè)為對照組。三．試劑1．一抗：鼠抗人HIF一1d單克隆抗體、鼠抗人多克隆抗體VEGF，購自Neomarker公司。2．UltraSensitiveSP試劑盒(鏈霉菌抗生物素蛋白一過氧化酶免疫組化染色超敏試劑盒)，購于福州邁新生物制品公司。該試劑盒的組成為，試劑A：即用型過氧化物酶阻斷劑，試劑B：即用型阻斷血清(10％正常動物非免疫血清)，試劑c：即用型生物素標(biāo)記的第二抗體，試劑D：即用型鏈霉菌抗生物素蛋白一過氧化物酶溶液。3．液體DAB酶底物

3、顯色試劑盒，購于福州邁新生物制品技術(shù)開發(fā)公司。該試劑盒由A，B，C三種溶液組成。使用時，取0．9ml蒸餾水中加A，B，C溶液各一滴混勻，避光存放，30分鐘內(nèi)有效。4．多聚L賴氨酸溶液，購于福州邁新生物制品技術(shù)開發(fā)公司。它作為粘片劑用于處理玻片，防止組織從切片上脫落。使用時，取多聚一L一賴氨酸i份，蒸餾水9份，混合均勻。將充分洗凈、預(yù)先干燥的玻片浸泡于稀釋后的多聚L一賴氨酸溶液數(shù)十秒，撈出于室溫下晾干或在45。C烤箱內(nèi)烘干。處理后的玻片可長期保存使用。溫州醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文5．磷酸鹽緩沖液(Phosphonatebuffe

4、rsolution，PBS)粉劑，購于福州邁新生物制品技術(shù)丌發(fā)公司。每袋用2000ml蒸餾水稀釋后其濃度為0．OiM，調(diào)節(jié)pH至7．207．40。6．抗原修復(fù)液：檸檬酸抗原修復(fù)緩沖液粉劑，購于福州邁新生物制品技術(shù)丌發(fā)公司。每袋用2000ml蒸餾水稀釋后其濃度為0．01M，調(diào)節(jié)pH至6．00。7．蘇木精素溶液，用于DAB顯色后的復(fù)染。8．其他如中性樹膠、酒精、二甲苯、伊紅等均為市售國產(chǎn)分析純。四．主要儀器設(shè)備奧林巴斯生物顯微鏡(CX31RBSF，Olympus，Japan)病理組織漂烘處理儀(PHYm型，國產(chǎn))LeiCa病

5、理切片機(RM3325，German)精密PH計(PHS一3C，上海雷磁儀器廠)微量移液器(20u，50u，國產(chǎn))隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱(PYx一型，國產(chǎn))電熱鼓風(fēng)干燥箱(CSl01—3型，國產(chǎn))恒溫培養(yǎng)箱(MIRl60／MIR260型，日本)載玻片(國產(chǎn))蓋玻片(國產(chǎn))高壓鍋(浙江蘇泊爾)電爐(浙江嘉興市風(fēng)橋電熱器廠)圖像采集系統(tǒng)圖像分析軟件Imageproplus5．02五．實驗方法1．免疫組織化學(xué)技術(shù)S—P法原理：免疫組織化學(xué)是根據(jù)免疫學(xué)和組織化學(xué)原理，用特殊標(biāo)記物標(biāo)記抗體或抗原，通過抗原抗體反應(yīng)在組織和細(xì)胞上進(jìn)行的

6、一種化學(xué)反應(yīng)，并利用化學(xué)反應(yīng)所呈現(xiàn)的顏色，在原位上確定組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)的化學(xué)成分和化學(xué)性質(zhì)。S-P法是其中一種染色方法，它采用生物素標(biāo)記的第二抗體與鏈霉菌抗生物素蛋白連接的過氧化物酶及基質(zhì)色素混合液來測定細(xì)胞和組織中的抗原。9溫州醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文2．實驗步驟如下：2．1載玻片的處理：將預(yù)先經(jīng)酸溶液和酒精浸泡、充分洗凈的玻片干燥后，浸泡于稀釋的多聚一L一賴氨酸溶液30一40秒，隨后置于45。C烤箱內(nèi)烘干。2．2組織切片的制作：將石蠟包埋的標(biāo)本于切片機上切取5um厚的組織切片，放入60℃電熱恒溫培養(yǎng)箱中1小時，烘干后常溫純二甲

7、苯脫蠟2次，每次10分鐘。2．3脫蠟后的切片依次置于濃度為100％、85％、80％、75％的系列酒精中逐級水化，然后用自來水沖洗至載玻片清潔透明，蒸餾水漂洗2次，每次1分鐘。2．4用0．01MPBS(pH7．4)沖洗3次，每次3分鐘。2．5每張切片滴加1滴(50u1)過氧化氫阻斷液(試劑A)，蒸餾水沖洗2次，0．01MPBS沖洗2次，每次3分鐘。2．6將切片放入盛有己煮沸的檸檬酸緩沖液的耐熱容器中，繼續(xù)加熱至沸騰(100。C)，維持5分鐘，取出容器置室溫冷卻20分鐘，取出切片，蒸餾水沈2次，再用PBS漂洗3次，每次2分鐘

8、。2．7每張切片滴加一滴非免疫性動物血清，室溫下孵育20分鐘。2．8滴加～抗(鼠抗人MIFla單克隆抗體、鼠抗人多克隆抗體VE6F濃縮液用PBS緩沖液按1：200稀釋成的工作液)，每例標(biāo)本分別滴加l滴第一抗體，陰性對照片則滴加1滴PBS液作為陰性對照。2．9室溫下孵育60分鐘，0．01MPBS沖洗3次，每次3分鐘。2