蛋白質(zhì)測定方法

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1、《西藏自治區(qū)林芝地區(qū)波密縣羊肚菌中蛋白質(zhì)干重含量的測定》具體實(shí)驗(yàn)方案蛋白質(zhì)測定方法方法靈敏度特點(diǎn)紫外吸收法較為靈敏用于層析柱流出液的檢測，核酸的吸收可以校正凱氏定氮法低（0.2-1.0mg）干擾少，費(fèi)時太長，用于標(biāo)準(zhǔn)蛋白的測定測定方法實(shí)驗(yàn)方案（1）紫外吸收法1.實(shí)驗(yàn)原理a.定性分析原理：吸收曲線：吸收峰的數(shù)目、位置、相對強(qiáng)度以及吸收峰的形狀.?b.定量分析原理：根據(jù)朗伯－比耳定律：A=εbc，當(dāng)入射光波長λ及光程b一定時，在一定濃度范圍內(nèi)，有色物質(zhì)的吸光度A與該物質(zhì)的濃度c成正比。???定量分析常用的方法是標(biāo)準(zhǔn)曲線法即只要繪出以吸光度A為縱坐標(biāo)，濃度c為橫坐標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，測出試液的吸光度，就可

2、以由標(biāo)準(zhǔn)曲線查得對應(yīng)的濃度值，即未知樣的含量。?????????????????2.儀器與試劑儀器：紫外-可見分光光度儀，比色管（10ml的5個），吸量管。試劑：標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：5.00mg/mL溶液、0.9%NaCl溶液，待測蛋白質(zhì)溶液（羊肚菌溶解液）。?3.實(shí)驗(yàn)步驟A.基本操作啟動計(jì)算機(jī)，打開主機(jī)電源開關(guān)，啟動工作站并初始化儀器,預(yù)熱半小時。用吸量管分別吸取0.6、0.8、1.0、1.2、1.4mL5.00mg/mL標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液于5只10mL比色管中，用0.9%NaCl溶液稀釋至刻度，搖勻。用1cm石英比色皿，以0.9%NaCl溶液為參比（參比溶液不可取出）.在工作界面上選擇測量項(xiàng)目為光

3、譜掃描，設(shè)置掃描參數(shù)（起點(diǎn)：400nm，終點(diǎn)：250nm，速度：中，間隔：1.0nm，單次掃描）將兩個均裝有0.9%NaCl溶液的1cm石英比色皿放入測量池中，進(jìn)行基線掃描，然后選定量測定，校零，在調(diào)回光譜掃描。B.吸收曲線的制作:（找出最大吸收波長）將放在前面的比色皿中溶液換為0.3mg/mL的蛋白質(zhì)溶液，點(diǎn)擊START進(jìn)行掃描，得到如下吸收曲線，從曲線中我們可以看出此標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液的最大吸收波長為278nm，此波長下的吸光度為0.1984。C.標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：在工作界面上選擇測量項(xiàng)目為光度測量設(shè)置測量條件（測量波長：278.00nm）。用1cm石英比色皿，以0.9%NaCl溶液為參比，在2

4、78nm處分別測定以上所配標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度A278，并以蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：D.樣品測定：配制三份待測蛋白質(zhì)溶液，（取待測蛋白質(zhì)溶液2.0mL分別于3只10mL比色管中，用0.9%NaCl溶液稀釋至刻度）按上述方法測定278nm處的吸光度。得吸光度依次為0.3906，0.3765，0.3848。平均值為A278=0.3840,根據(jù)樣品溶液的吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出待測蛋白質(zhì)的濃度為0.6101mg/mL。轉(zhuǎn)換后待測蛋白質(zhì)溶液的濃度為C=0.6101mg/mL?10mL/2.0mL=3.0505mg/mL。4.注意事項(xiàng)A.準(zhǔn)備工作：在測量前應(yīng)把機(jī)器預(yù)熱半小時。溶液一定

5、要配制準(zhǔn)確,以防影響實(shí)驗(yàn)效果,保證點(diǎn)在一條直線上。由于蛋白質(zhì)的紫外吸收峰常因PH值的改變而改變，故進(jìn)行樣品測定時的PH最好與標(biāo)準(zhǔn)曲線制作時的PH值一致。B.測量工作：吸收曲線繪制前必須進(jìn)行光譜的掃描。在作標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量前一定要選擇最大的吸收波長,確保靈敏度高。在實(shí)際操作中，比色皿在使用中應(yīng)注意保持干凈，更不能觸摸比色皿的光面，以防摩擦影響通光。（2）凱氏定氮法1.實(shí)驗(yàn)原理?蛋白質(zhì)是含氮的化合物。食品與濃硫酸和催化劑共同加熱消化，使蛋白質(zhì)分解，產(chǎn)生的氨與硫酸結(jié)合生成硫酸銨，留在消化液中，然后加堿蒸餾使氨游離，用硼酸吸收后，再用鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，根據(jù)酸的消耗量來乘以蛋白質(zhì)換算系數(shù)，即得蛋白質(zhì)含量

6、。?因?yàn)槭称分谐鞍踪|(zhì)外，還含有其它含氮物質(zhì)，所以此蛋白質(zhì)稱為粗蛋白。?2.儀器與試劑?硫酸銅（CuSO4·5H20）??硫酸鉀????硫酸（密度為1.8419g/L）??硼酸溶液（20g/L）?氫氧化鈉溶液（400g/L）??0.01mol/L鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液。?混合指示試劑：0.1%甲基紅乙溶液液1份，與0.1%溴甲酚綠乙醇溶液5份臨用時混合。?微量定氮蒸餾裝置。?3.實(shí)驗(yàn)步驟?樣品消化?稱取樣品約2.00g（±0.001g），移入干燥的100mL凱氏燒瓶中，加入0.2g硫酸銅和6g硫酸鉀，稍搖勻后瓶口放一小漏斗，加入20mL濃硫酸，將瓶以450角斜支于有小孔的石棉網(wǎng)上，使用萬用電爐，在通

7、風(fēng)櫥中加熱消化，開始時用低溫加熱，待內(nèi)容物全部炭化，泡沫停止后，再升高溫度保持微沸，消化至液體呈藍(lán)綠色澄清透明后，繼續(xù)加熱0.5h，取下放冷，小心加20mL水，放冷后，無損地轉(zhuǎn)移到100mL容量瓶中，加水定容至刻度，混勻備用，即為消化液。?試劑空白實(shí)驗(yàn)：取與樣品消化相同的硫酸銅、硫酸鉀、濃硫酸，按以上同樣方法進(jìn)行消化，冷卻，加水定容至100mL，得試劑空白消化液。?定氮裝置的檢查與洗滌?檢查微量定