膽堿酯酶抑制法檢測辛硫磷農(nóng)藥殘留

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1、第27卷第2期河北師范大學學報(自然科學版)Vol.27No.22003年3月JournalofHebeiNormalUniversity(NaturalScienceEdition)Mar.2003膽堿酯酶抑制法檢測辛硫磷農(nóng)藥殘留侯學文,何衍彪,徐漢虹(華南農(nóng)業(yè)大學資源環(huán)境學院,廣東廣州510642)摘要:利用膽堿酯酶水解碘化硫代丁酰膽堿后形成的硫代膽堿,與二硫雙對硝基苯甲酸發(fā)生化學反應生成黃色產(chǎn)物,在412nm比色測定.利用此法測定酶、底物的添加量以及保溫溫度和保溫時間對酶活力的影響,還研究了不同濃度與保溫時間的辛硫磷對膽堿酯酶活力的抑制情況.獲得了膽堿酯酶優(yōu)化的反應條件,結(jié)果還表明膽堿

2、酯酶對辛硫磷比較敏感,其抑制中濃度為I50為3.9049μg/L.關(guān)鍵詞:膽堿酯酶;辛硫磷;農(nóng)藥殘留++中圖分類號:Q556.1;S481.8文獻標識碼:A文章編號:1000-5854(2003)02-0181-040前言農(nóng)藥的使用是保障農(nóng)業(yè)豐收的必要手段,但由于我國農(nóng)藥結(jié)構(gòu)不合理以及規(guī)范用藥意識差,使得因食用農(nóng)藥殘留超標蔬菜而中毒的事件屢屢發(fā)生,這引起了人們的關(guān)注,迫切要求有適當?shù)募夹g(shù)來監(jiān)控農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留情況.有機磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥是造成農(nóng)藥中毒事件的主要元兇,它們都是通過抑制乙酰膽堿酯酶的活力而發(fā)揮作用的,因此可以采用體外檢測膽堿酯酶的活力抑制情況來表征此類農(nóng)藥[1]的含量.應用此檢

3、測法的關(guān)鍵是要獲得對主要農(nóng)藥敏感、活力高的膽堿酯酶,筆者通過前期工作已獲得一較好的酶源,為了能實際應用,必須建立起相應的檢測條件,包括對試劑用量、保溫溫度、保溫時間及對農(nóng)藥的靈敏度等情況進行研究.1試驗材料與方法1.1試驗材料1.1.1供試材料及試劑碘化硫代丁酰膽堿(BTCI)和二硫雙對硝基苯甲酸(DTNB)為Fluka及Aldrich公司產(chǎn)品;膽堿酯酶由華南農(nóng)業(yè)大學昆蟲毒理研究室提供;辛硫磷原藥(91.1%)為廣州農(nóng)藥廠產(chǎn)品;其余試劑均采用國產(chǎn)分析純.1.1.2主要儀器設備分光光度計,水浴加熱器,pH檢測計等.1.2試驗方法1.2.1試劑配制方法磷酸緩沖液是用0.1mol/L的磷酸氫二鈉和

4、磷酸二氫鈉溶液,在pH計監(jiān)控下以適當比例混合,分別配制pH為5.0,5.5,6.0,6.5,7.0,7.5,8.0,9.0的磷酸緩沖液;酶液是取60mg膽堿酯酶粉溶于8mL(pH8.0)的磷酸緩沖液而成;BTCI溶液是稱取100mgBTCI溶于10mL(pH8.0)的磷酸緩沖液;DTNB溶液是稱取60mgDTNB溶于10mL(pH8.0)的磷酸緩沖液;辛硫磷溶液是用pH8.0的磷酸緩沖液分別配制濃度為2.0,1.0,0.5,0.25,0.125,0.0625mg/L的藥液,現(xiàn)配現(xiàn)用.1.2.2底物濃度與膽堿酯酶活力關(guān)系[2]膽堿酯酶活力分析采用Ellman法.在干凈試管中加入pH為8.0的磷

5、酸緩沖液,50μLDTNB溶收稿日期:20020703;修回日期:20021122基金項目:農(nóng)業(yè)部農(nóng)藥檢定所合作推廣項目作者簡介:侯學文(1969),男,四川崇州人,華南農(nóng)業(yè)大學副教授,主要從事農(nóng)藥生物技術(shù)的研究工作.182河北師范大學學報(自然科學版)第27卷液、50μL酶液,在37℃下水浴保溫30min,測定前加入相應量的BTCI溶液,調(diào)整磷酸緩沖液與BTCI的量,使反應總體積為3.15mL,立即在412nm比色測定反應液的OD值,記錄0,180s讀數(shù),計算ΔOD值,每個濃度重復3次,以平均值計算.1.2.3酶量對反應的影響在干凈試管中加入pH8.0的磷酸緩沖液,50μLDTNB溶液,適

6、量酶液,在37℃下水浴保溫30min,測定前加入50μLBTCI溶液,調(diào)整磷酸緩沖液與酶液量,使反應總體積為3.15mL,立即在412nm比色測定反應液的OD值,記錄0,180s讀數(shù),計算ΔOD值,每個濃度重復3次,以平均值計算.1.2.4緩沖液pH值對酶活力的影響在干凈試管中分別加入pH為5.0,5.5,6.0,6.5,7.0,7.5,8.0,8.5,9.0的磷酸緩沖液3mL,再加入50μLDTNB溶液、50μL酶液,在37℃下水浴保溫30min,測定前加入50μLBTCI溶液,混勻后在412nm比色測定.1.2.5保溫溫度對酶活力的影響在干凈試管中加入pH8.0的磷酸緩沖液,50μLDT

7、NB溶液,適量酶液,分別在20,25,30,35,40,45,50℃下水浴保溫30min,測定前加入50μLBTCI溶液,立即在412nm比色測定3min前后反應液的OD值.1.2.6農(nóng)藥與酶作用時間對酶活力的影響在干凈試管中加入3mL0.006mg/L辛硫磷溶液,再加入50μLDTNB溶液、50μL酶液,分別在37℃下水浴保溫0,5,10,15,20,25,30min,測定前加入50μLBTCI溶液,立即在