膜分離技術(shù)在靈芝多糖提取中的應(yīng)用

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1、膜分離技術(shù)在靈芝多糖提取中的應(yīng)用1?12楊虎、許振良、平鄭驊1（華東理工大學(xué)化學(xué)工程研究所膜科學(xué)與工程研發(fā)中心，上海2002372復(fù)旦大學(xué)高分子科學(xué)系）摘要：采用膜技術(shù)對靈芝多糖進(jìn)行分級，研究了其通量的變化以及膜清洗過程，并測定了分級后靈芝多糖對T、B淋巴細(xì)胞的增殖反應(yīng)效果。結(jié)果表明多糖溶液的膜分離過程中，最初通量降低很快，隨后膜的通量基本保持恒定。被污染的膜用0.1M的稀堿溶液清洗0.5小時后，膜的純水通量基本恢復(fù)。分級后靈芝多糖顯示出明顯的免疫功效，特別是分子量大于30萬的靈芝多糖對T、B細(xì)胞的增殖作用十分顯著。說明選擇適宜的工藝

2、條件，采用膜技術(shù)對靈芝多糖分級應(yīng)用是有效的。關(guān)鍵詞：靈芝多糖;膜分離;免疫促進(jìn)靈芝[ganodermalucidum]具有廣泛的藥理活性，能提高機(jī)體免疫力，增強(qiáng)機(jī)體耐缺氧能力，清除自由基，抑制腫瘤，能使人體產(chǎn)生抗體及干擾素，可治療高血壓、血脂、糖尿病、乙型肝炎等多種疑難病癥[1]。傳統(tǒng)工藝（水提醇沉、冰凍干燥法等）提取的靈芝多糖生產(chǎn)周期長，能耗大，易導(dǎo)致有效成分損失。靈芝多糖(Polysaccharide)是靈芝的主要活性成分，研究表明，靈芝多糖的結(jié)構(gòu)、分子量與其生物學(xué)活性相關(guān)[2-3]。本研究的重點是采用膜技術(shù)獲得不同分子量級份靈芝

3、多糖，研究它們的生物活性，篩選出具有高活性的分子量級份，為靈芝多糖的綜合利用創(chuàng)造條件。1材料和方法1.1儀器和材料紫外吸收光度計（上海光學(xué)儀器廠），德國耐馳公司TGA，以及小型平板超濾器（上海應(yīng)用物理研究所），葡萄糖，硫酸、乙醇(均為分析純)，苯酚及其他化學(xué)試劑購自上海試劑總公司，分離膜（截留分子量10萬的聚醚砜膜、7萬和1萬的聚丙烯晴膜）購自上海應(yīng)用物理研究所，截留分子量為30萬的聚醚砜膜購自millipore公司。靈芝購于上海雷允上藥店。1.2提取分離方法及測試靈芝多糖的提?。菏惺垤`芝500克，粉碎后經(jīng)甲醇提取除去三萜后，依次用2

4、0倍、10倍、10倍水分別煎煮1h、1h、0.5h，抽濾后合并濾液并濃縮至原體積的1/10左右（原液）。加入4倍的95%乙醇攪拌后，在冰箱中靜置12小時后離心去除上清液。沉淀部分依次用無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌?通訊聯(lián)系人，華東理工大學(xué)化學(xué)工程研究所。Tel:021-64253792Email:kuleuven@yahoo.cn1后真空干燥，即得到粗多糖。提取液的固含量采用稱重法，即稱取一定量的溶液，干燥后測定其含量。兩者之比為其固含量。2膜過濾：室溫下采用小型平板超濾器進(jìn)行分離。溶液濃度為2%，單片膜面積為16cm，操作壓力0.15M

5、pa。得到各種級份的多糖溶液后冷凍干燥，備用。使用后的分離膜分別采用純水和清洗后，測定其對于純水的通量。通量的定義為單位時間、通過單位面積膜的水溶液的體積。2結(jié)果2.1靈芝提取得率及組成分析靈芝水提物得率為2.2%，進(jìn)一步沉淀后粗多糖的得率約為0.5%（誤差范圍10%）。較低的得率可能是提取時間短使細(xì)胞內(nèi)的多糖沒有充分析出。測定靈芝水提物（原液）膜過濾后的不同分子量級份中多糖、蛋白質(zhì)等不同成份的含量，結(jié)果見表1。其中多糖測定采用苯酚－硫酸法[4]；多糖在濃硫酸水合產(chǎn)生的高溫下迅速水解，產(chǎn)生單糖，單糖在強(qiáng)酸條件下與苯酚反應(yīng)生成橙色衍生物

6、。在波長490nm左右處和一定濃度范圍內(nèi)，該衍生物的吸收值與單糖濃度呈線性關(guān)系。本實驗采用葡萄-3糖制備標(biāo)準(zhǔn)溶液，獲得的回歸方程為A=3.1*10+62.5C，回歸系數(shù)為0.9991，多糖與葡萄糖的換算系數(shù)為6.1。蛋白質(zhì)采用sevag法測定。樣品中的無機(jī)物成份的含量采用德國耐馳公司TGA儀測定，升溫速度為10°C/min，升溫范圍25°C~300°C，氮氣保護(hù)。殘渣主要為無機(jī)或含金屬離子的成份。表1膜分離后各個級分所占的比例以及其中主要成分的含量水提物M>30萬M＝30~10萬M＝10~7萬M＝7~1萬M<1萬固含量（%）10013

7、.611.67.84.73.6水分（%）04.15.75.83.90殘渣（5）7.38.014.412.836.071.5多糖（%）50.456.559.361.349.610.6蛋白質(zhì)（%）12.57.45.34.45.20其它（%）29.828.118.315.75.317.92.2免疫生物活性實驗脫出蛋白后的不同分子量的多糖級分在國家新藥篩選中心做T、B淋巴細(xì)胞的增殖反應(yīng)及細(xì)胞毒性實驗。篩選方法原理為：淋巴細(xì)胞在有絲分裂原ConA，LPS的刺激下，細(xì)胞的形態(tài)和代謝可發(fā)生一系列的變化，轉(zhuǎn)化為母細(xì)胞，并分化增殖。實驗中加入ConA（

8、刀豆蛋白A）5μg/ml誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞增殖。加入LPS（脂多糖）10μg/ml誘導(dǎo)B淋巴細(xì)胞增殖。以3H-TdR摻入法定量測定細(xì)胞的增殖?；罴?xì)胞內(nèi)線粒體脫氫酶能將MTT有黃色還原成藍(lán)色的甲肷，甲肷產(chǎn)量與活細(xì)胞成正比。用有