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《安全轉(zhuǎn)基因油菜獲得及其抗菌核病的研究》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫(kù)。
1、摘要安全轉(zhuǎn)基因油菜的獲得及其抗菌核病研究植物學(xué)專業(yè)碩士研究生唐巧指導(dǎo)教師羅克明教授油菜是我國(guó)重要的油料作物，菌核病作為油菜生產(chǎn)中最主要的病害，嚴(yán)重影響著我國(guó)油菜的品質(zhì)和產(chǎn)量，因此，控制油菜菌核病已成為當(dāng)前油菜生產(chǎn)中亟待解決的問(wèn)題。盡管轉(zhuǎn)基兇技術(shù)已在多種作物中取得了巨大的成功，但公眾對(duì)轉(zhuǎn)基因作物生物安全性問(wèn)題的日益擔(dān)憂，明顯限制了轉(zhuǎn)基因技術(shù)在油菜育種中的應(yīng)用。研究表明，來(lái)自益母草的抗真菌蛋白基因刪腳2，經(jīng)離體試驗(yàn)結(jié)果顯示對(duì)菌核病菌(＆如rDf擁誼船，BrDf幻朋朋)具有很強(qiáng)的抗性。同時(shí)，‘‘‘kne．deletor”刪除系統(tǒng)在煙草上的成功應(yīng)用，消除了轉(zhuǎn)基因植物中可能存在的
2、生物安全性問(wèn)題。故在本研究中，我們將益母草脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白基因L陰魍搭建在“Ge鵬．deletor’刪除系統(tǒng)內(nèi)并轉(zhuǎn)化油菜，獲得安全轉(zhuǎn)基因油菜。本研究的完成，可望為轉(zhuǎn)基因作物生物安全性的控制提供一個(gè)應(yīng)用于大田生產(chǎn)的技術(shù)手段。研究?jī)?nèi)容如下：l、含有抗菌肽基因刪腳2的刪除系統(tǒng)載體pBGP．FIJP．L1：P．GN的構(gòu)建擴(kuò)增目的基因刪MP2連接pCXSN載體，測(cè)序正確后，雙酶切含目的基因的克隆載體pCXsN-UMP2和載體質(zhì)粒pBGP．FLP．GN，將目的片段35S-LJAMP2．Nos與載體pBGP．FLP．GN酶切大片段連接，構(gòu)建成植物表達(dá)載體pBGP．FLP．L11P．GN并
3、轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH50【，經(jīng)檢測(cè)驗(yàn)證正確后，最后轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHAl05得到植物表達(dá)載體EHAl05．pBGP．FLP．U甲．GN。2、根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的油菜菜遺傳轉(zhuǎn)化及分子檢測(cè)以油菜品種中油82l的下胚軸作為轉(zhuǎn)基因受體材料，利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化來(lái)源于益母草的陽(yáng)離子抗菌肽基因刪腳2，由花粉特異性啟動(dòng)子基因BGP控制的刪除系統(tǒng)載體pBGP．FLP．GN，以及含有抗菌肽基因刪脫P(yáng)2的刪除系統(tǒng)載體pBGP．FLP．LTP．GN。經(jīng)高濃度卡那霉素篩選培養(yǎng)后獲得油菜抗性植株。通過(guò)GUS組織化學(xué)染色和PCR驗(yàn)證共獲得3個(gè)轉(zhuǎn)刪M匕基因油菜株系，4個(gè)轉(zhuǎn)pBGP．FLP．GN基因油菜株系，
4、1個(gè)轉(zhuǎn)pBGP．FLP．LTP．GN基因油菜株系，檢測(cè)結(jié)兩南入學(xué)碩十學(xué)何’淪文果均呈陽(yáng)性，初步證明外源目的基因已整合到油菜基因組中。RT-PCR證實(shí)刪脫P(yáng)2和凡P基因分別在轉(zhuǎn)刪肋乃和轉(zhuǎn)pBGP．FLP．GN油菜植株中均能大量表達(dá)。3、轉(zhuǎn)刪腳2基因油菜抗病性檢測(cè)體外抑菌試驗(yàn)表明，轉(zhuǎn)L朋朋rP2基因油菜細(xì)胞粗提液對(duì)菌核病病菌的菌絲抑制力明顯強(qiáng)于非轉(zhuǎn)基因油菜細(xì)胞粗提液。進(jìn)一步將菌核病病菌接種在轉(zhuǎn)基因和野生型油菜葉片上離體培養(yǎng)，結(jié)果顯示野生型植株葉片感病快且面積大，而轉(zhuǎn)刪朋rP2基兇植株葉片僅少面積感病。顯微鏡下觀察葉片體內(nèi)病菌菌絲侵染情況，發(fā)現(xiàn)菌核病病蔭的菌絲在非轉(zhuǎn)基因油菜植
5、株中形態(tài)正常，而在轉(zhuǎn)刪膨P2基因植株葉片中，菌絲變厚變粗，且表現(xiàn)為卷曲形態(tài)，在葉片內(nèi)擴(kuò)散速度和擴(kuò)散面積也小于非轉(zhuǎn)基因植株葉片。上述抗性試驗(yàn)結(jié)果表明，在油菜中超量表達(dá)刪腳2基因能顯著提高對(duì)油菜菌核病的抗性。4、轉(zhuǎn)pBGP．FLP．GN載體油菜刪除效率檢測(cè)比較處于發(fā)育相同階段的野生型花粉粒，以及轉(zhuǎn)刪朋n基因油菜花粉粒的GUS組織化學(xué)染色結(jié)果，可初步證實(shí)在轉(zhuǎn)pBGP．FIJP．GN基因油菜的花粉粒中已實(shí)現(xiàn)基因刪除。迸一步比較轉(zhuǎn)pBGP．FIJP．GN基因油菜不同階段花粉粒染色結(jié)果，顯示花粉粒顏色由藍(lán)色逐漸朝黃色變化。對(duì)所有計(jì)數(shù)花粉粒進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)pBGP．FLP．G
6、N載體油菜刪除效率為82．51％。上述結(jié)果表明，含有pBGP．FLP．GN載體的轉(zhuǎn)基因油菜植株的刪除效率較高，已達(dá)到一個(gè)明顯的刪除效果。關(guān)鍵詞：油菜；L陰膨P2基因；基因刪除；刪除系統(tǒng)l抗?、駻bstractGenerationoftransgenicoilseedrapewithoutbiosafetyconcernsandstudyonitsresistanceto—T．●●1．●6’CZP加以門Z以SCZP加以D廠“mM勾or：BotanyGraduate：QiaoTangSupeⅣisor：Pro￡KernjngLuoOilseedrape∞m嘶∞以印螂)ist
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