溶瘤腺病毒介導(dǎo)rna干擾抑制肝癌細胞生長實驗的研究論文

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1、博士學(xué)位論文溶瘤腺病毒介導(dǎo)的RNA干擾抑制肝癌細胞生長的實驗研究博士研究生：孫其酷指導(dǎo)教師：盧坤平教授馬文麗教授摘要研究背景和目的原發(fā)性肝癌是一種常見的惡性腫瘤，藥物是治療原發(fā)性肝癌的重要手段。大量臨床實踐㈦21和實驗研究【13。17】表明，復(fù)方苦參注射液對肝癌有較好的治療效果【1，8，9，171?，F(xiàn)代研究證實，復(fù)方苦參注射液具有抑制腫瘤細胞增殖，誘導(dǎo)腫瘤細胞分化和促進腫瘤細胞凋亡等作用【13。16，18之31。復(fù)方苦參注射液雖然在肝癌的治療過程中能發(fā)揮出較好的抗癌效果，但是與大多數(shù)中藥一樣，也存在有效成分不明確，質(zhì)量控制標準復(fù)雜，不同廠家和不同批次的產(chǎn)品治療效果不一致等等問題和缺點【2

2、4之引。隨著現(xiàn)代生物科技的發(fā)展，人類對藥物作用機制的研究已經(jīng)深入到了分子水平，并逐步向系統(tǒng)化方向發(fā)展。綜合基因表達譜芯片的研究結(jié)果129‘31】、免疫組化的研究結(jié)果以及對關(guān)鍵基因在轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平的具體分析結(jié)果【13’21，32‘351，目前認為，復(fù)方苦參注射液主要從以下幾個方面發(fā)揮其抗癌作用：1、對腫瘤細胞的直接殺傷作用：復(fù)方苦參注射液能夠抑制腫瘤細胞內(nèi)細胞周期蛋白El(CyclinE1)、生存素(Survivin)和B細胞淋巴瘤／白血病-2基因(B—celllymphoma／Leukemia-2，Bcl．21的表達，進而導(dǎo)致腫瘤細胞內(nèi)Caspase．3的大量表達與激活，從而引起腫瘤

3、細胞大量凋亡，達到直接殺傷腫瘤細胞的目的【13,21,32】。2、對腫瘤細胞的間接殺傷作用：復(fù)方苦參注射液能夠上調(diào)Fas等死亡受體在腫瘤細胞表面的表達，進而通過機體免疫系統(tǒng)，如特異性T細胞的細胞毒作用，摘要達到間接殺傷腫瘤細胞的目[拘[13,30,31】。3、抑制腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移：復(fù)方苦參注射液能促進腫瘤細胞表達抑制轉(zhuǎn)移因子nIn23【161，還能抑制腫瘤細胞表達粘附分子CD44v6，進而抑制腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移【19】。4、抑制腫瘤血管的生成：復(fù)方苦參注射液能抑制腫瘤細胞表達VEGF和CXCR4，這可能是復(fù)方苦參注射液抑制腫瘤血管生成的主要分子機$1J[33,34,36-3鍆。5、復(fù)方苦參注

4、射液還具有緩解疼痛、提高患者生存質(zhì)量和提高機體免疫力等方面的作用【39．541。有鑒于此，本研究設(shè)計構(gòu)建了一個攜帶RNA干擾序列的溶瘤腺病毒，用RNA干擾的方法，靶向抑制肝癌細胞內(nèi)CyclinE1、Survivin和Bcl．2的表達，參照復(fù)方苦參注射液直接殺傷腫瘤細胞的主要分子作用機制進行RNA干擾治療，既克服了傳統(tǒng)中藥的許多缺點，又充分發(fā)揮了基因治療的優(yōu)勢，從而使構(gòu)建的攜帶RNA干擾序列的溶瘤腺病毒具備較好的抗癌能力，并有望發(fā)展成為一種新的用于腫瘤治療的基因藥物。復(fù)方苦參注射液可以通過抑制腫瘤細胞內(nèi)CyclinE1、Survivin和Bcl．2的表達來發(fā)揮其直接殺傷作用。而這三個蛋白在

5、細胞的癌變和腫瘤細胞的增殖與凋亡過程中也扮演著重要的角色。其中CyclinE1和Survivin的過表達，是引起癌細胞周期調(diào)控異常和過度增殖的關(guān)鍵因素155拼】。而Bcl．2和Survivin則是導(dǎo)致癌細胞凋亡異常的核心因子【65擊91。CyclinE1過表達會導(dǎo)致細胞G1期進程縮短，細胞增殖失控，進而促進細胞的惡性轉(zhuǎn)化。抑制癌細胞的CyclinE1的表達，可以使其細胞周期停滯在G0／G1期，阻止其進入S期，從而起到抑制細胞增殖的作用【55’加1；Survivin則同時具備調(diào)節(jié)細胞周期和抑制細胞凋亡的雙重作用，是聯(lián)系細胞周期和細胞凋亡的關(guān)鍵因子，抑制癌細胞中Survivin的表達，可以抑

6、制肝癌細胞增殖，促進肝癌細胞凋亡【71。75】；Bcl．2在癌細胞抗凋亡過程中也發(fā)揮著重要作用，并且與Survivin有協(xié)同效應(yīng)【65,76-79】，因此只有同時抑制Survivin和Bcl．2的表達，才能較好的抑制其抗凋亡作用，促使癌細胞走向凋亡。RNA干擾(RNAi，RNAinterference)作為一種抑制癌基因表達的手段，早已在腫瘤的治療方面得到應(yīng)用【80，811。常用的藥物導(dǎo)入方法有兩種，一種是體外合II博士學(xué)位論文成RNAi片段后，直接注射使用；另一種是構(gòu)建RNAi表達載體，然后將載體導(dǎo)入細胞內(nèi)，使其在細胞內(nèi)表達相應(yīng)的RNAi片段，達到治療目的。前一種直接注射法雖然簡單，但

7、存在免疫反應(yīng)大，RNAi片段在體內(nèi)大量降解，利用率低，治療效果差等缺點，逐漸被淘汰【821。在第二種治療方法中，載體的選擇是關(guān)鍵，使用普通載體，如pGene．sil，存在轉(zhuǎn)染效率低，抑制作用持續(xù)時間短，免疫反應(yīng)大等缺點，無法在實際應(yīng)用中取得良好效果[s3】。所以本研究采用溶瘤腺病毒(OncolyticAdenovirus)作為RNAi的載體，由于溶瘤腺病毒能夠特異性的在腫瘤細胞中復(fù)制增殖，并能在腫瘤組織間自行擴散‘s4-ss]，因此