珍稀瀕危植物裸果木rapd反應(yīng)體系優(yōu)化探究

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1、珍稀瀕危植物裸果木RAPD反應(yīng)體系優(yōu)化探究摘要：以裸果木新鮮葉片為材料，采用改進(jìn)CTAB法提取基因組DNA,在參考一般RAPD分析反應(yīng)程序的基礎(chǔ)上,研究了裸果木RAPD分析過程中的影響因素Taq酶、Mg2+、dNTP、引物、模板DNA濃度、變性時(shí)間等，建立了適于裸果木RAPD反應(yīng)的PCR體系：模板DNA為4ng/uL,引物濃度為0.3nmol/L,dNTP濃度為0.5mmol/L,Mg2+濃度為2.0mmol/L,Taq酶用量為1U,ddH20補(bǔ)足25uL；94°C預(yù)變性5min,94°C變性45s,36°C退火40s,72°C延伸

2、1min,共30個(gè)循環(huán)，最后72瓦延伸10min,擴(kuò)增結(jié)果穩(wěn)定。關(guān)鍵詞：裸果木；RAPD；反應(yīng)體系；優(yōu)化中圖分類號(hào)：Q78文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1009?5500(2012)01?0007?05裸果木(Gymnocarposprzewalskii)隸屬石竹科(Caryophyllaceae)裸果木屬(Gymnocarpos),主要分布在新疆南部山區(qū)、甘肅河西走廊、青海西部、內(nèi)蒙古西部、寧夏東南部(沙坡頭地區(qū))[1]。裸果木是古地中海荒漠殘遺種，屬于珍稀植物，為1987年我國首批公布的國家二級(jí)保護(hù)植物，1997年被定為一級(jí)保護(hù)植

3、物。對研究我國西北和內(nèi)蒙古荒漠的發(fā)生、發(fā)展、氣候變化及旱生植物區(qū)系成分的起源有著非常重要的科學(xué)價(jià)值[2]。近年來，由于生存環(huán)境的惡化，及自身生物學(xué)因素，又遭樵采和駱駝啃食等人類各種經(jīng)濟(jì)活動(dòng)的干擾和破壞，裸果木的種群數(shù)量急劇減少，分布區(qū)已日益縮小和片段化[3]。開展種群遺傳學(xué)研究，制定相關(guān)的保護(hù)計(jì)劃，是保護(hù)其的有效途徑。目前有關(guān)裸果木的相關(guān)研究主要集中在形態(tài)解剖學(xué)[4,5]、生理生態(tài)[6-8]、組織培養(yǎng)和擴(kuò)繁[9]以及化學(xué)成分研究：10]等方面，有關(guān)分子水平的研究較少。隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(RAPD)技術(shù)是以P

4、CR為基礎(chǔ)的一種分子標(biāo)記,具有操作簡便、快速、低成本、多態(tài)性檢出率高等優(yōu)點(diǎn)[11],在遺傳多樣性評(píng)價(jià)、物種分類與鑒定、遺傳圖譜構(gòu)建等方面有廣泛的應(yīng)用[12,13],由于RAPD引物的隨機(jī)性及較低的退火溫度等導(dǎo)致的條件不穩(wěn)定等，影響了該技術(shù)的應(yīng)用。在應(yīng)用該技術(shù)時(shí)，通常需要對其反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化,以提高其穩(wěn)定性。為此進(jìn)行了裸果木RAPD體系的構(gòu)建和優(yōu)化試驗(yàn)，為開展裸果木種質(zhì)資源保護(hù)和管理提供有價(jià)值的科學(xué)參考。1材料和方法1.1材料自2008?2009年10月，采集了甘肅省肅北縣紅柳峽口子干溝一帶裸果木葉片若干。試劑40個(gè)10bp大

5、小的RAPD隨機(jī)引物、Taq酶、lOXTaq緩沖液、Mg2+、dNTP均購自大連寶生物有限公司；瓊脂糖、DNAMarker等均購自天為時(shí)代科技有限公司。1.2方法1.2.1裸果木DNA提取及濃度、純度檢測DNA提取按改良CTAB法進(jìn)行[14]。在紫外分光光度計(jì)上，檢測DNA樣品的濃度和純度。1.2.2RAPD?PCR反應(yīng)體系的建立及優(yōu)化PCR反應(yīng)在PE480型DNA擴(kuò)增儀中進(jìn)行。參考一般反應(yīng)體系[15],分別在25UL反應(yīng)體系中加入模板DNA、Mg2+、dNTP、Taq酶、引物和ddH20o之后蓋上蓋子振蕩混勻。設(shè)置94￡預(yù)

6、變性5min,30個(gè)循環(huán)進(jìn)行94°C變性45s,36°C退火40s,72°C延伸1min,72°C延伸10min。優(yōu)化RAPD反應(yīng)體系時(shí)，固定擴(kuò)增程序，每次改變RAPD反應(yīng)中的1個(gè)參數(shù)，以確定該參數(shù)對RAPD結(jié)果的影響。篩選的參數(shù)包括：（1）模板DNA質(zhì)量濃度；（2）dNTPs濃度；⑶引物用量；（4）Mg2+濃度。同時(shí)對擴(kuò)增程序中的退火溫度和變性時(shí)間也進(jìn)行優(yōu)化，以找到合適的反應(yīng)條件。2結(jié)果與分析2.1提取的模板DNA濃度和質(zhì)量對提取的裸果木基因組DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。DNA條帶明亮，無嚴(yán)重拖尾和降解現(xiàn)象，可見所提取的基因組DNA

7、較完整，質(zhì)量較高，能應(yīng)用于RAPD反應(yīng)分析（圖1）。與入DNA的濃度梯度進(jìn)行比較，估測出DNA的濃度為100ng/uL左右。經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測，D260mm/D280mm比值均在1.6?1.9。圖1DNA電泳檢結(jié)果Fig.ITheDNAelectrophoreticbandsextractedfromleaves1.2RAPD反應(yīng)體系優(yōu)化和程序確立1.2.1反應(yīng)體系優(yōu)化結(jié)果（l）DNA模板濃度根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)設(shè)置了0.4、2.0、4.0、6.0、8.0ng/uL5個(gè)DNA模板濃度梯度。模板DNA用量為10ng時(shí)，擴(kuò)增條帶暗淡；之后，隨著

8、模板DNA用量的增加（2.0?6.0ng/uL）,條帶逐漸清晰、明亮，當(dāng)模板DNA用量4.0ng/uL時(shí)，擴(kuò)增效果最佳;其大于6.Ong/11L時(shí)，條帶數(shù)目逐漸減少。這表明模板DNA用量過少時(shí)，擴(kuò)增產(chǎn)物太少且條帶也暗淡（圖2）o模板D