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《als轉基因小鼠腰髓自噬改變及饑餓誘導自噬對突變蛋白表達影響》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關內容在學術論文-天天文庫。
1、中文摘要ALS轉基因小鼠腰髓自噬改變及饑餓誘導自噬對突變蛋白表達的影響摘要目的：肌萎縮側索硬化(amyotrophiclateralsclerosis，ALS)是一種神經系統變性疾病，其特征為選擇性損害運動皮層、腦干及脊髓前角的運動神經元，表現為肌無力、肌肉萎縮、肌束震顫、腱反射亢進及病理征陽性，進行性加重，最終呼吸衰竭死亡。絕大部分的ALS為散發(fā)性(90％～95％)，約5％～10％的ALS為家族性，約20％的家族性ALS與C“Zn超氧化物歧化酶(SODl)基因突變有關。目前該病發(fā)病機制尚不清楚，但隨著病
2、情進展突變SODl蛋白的聚集、泛素陽性包涵體的形成是ALS的兩個重要病理特征。突變的SODl蛋白首先發(fā)生錯誤折疊、構象改變，暴露出蛋白內部的疏水殘基，然后激活細胞內的蛋白酶體系統清除錯誤折疊蛋白，但是此途徑只能對單體蛋白的降解起到作用，在一定程度上延緩了蛋白聚集物的形成。隨著病程進展，受損蛋白的不斷增多，當蛋白酶體系統不足以完全清除這些蛋白的時候，蛋白酶體系統的成分如泛素也將參與聚集物的形成，并捕獲受損的細胞器，形成難以降解的包涵體，細胞自噬可以降解具有聚集傾向的蛋白，因此細胞自噬溶酶體系統在SODl突變
3、的ALS轉基因小鼠中對突變蛋白降解起著極為重要的作用。自噬是一種生物長期進化保留下來的、受嚴格調節(jié)的、用于長壽命蛋白質以及細胞器等胞漿成分的降解與循環(huán)再利用的生物過程。自噬現象首先在酵母中被發(fā)現，后研究發(fā)現自噬普遍存在于真核細胞，通過溶酶體吞噬降解自身成分，是細胞內再循環(huán)的系統，也是一種重要的防御和應激調控機制，細胞在受到外界條件的刺激(如饑餓)或者其內部條件發(fā)生變化(損傷的細胞器和胞質成分積聚)時都可以產生自噬。細胞可以通過自噬和溶酶體降解消化變性衰老的細胞、受損細胞器或變性蛋白質等使之免受細胞內毒物的
4、損傷。自噬主要以細胞成分包括蛋白質和細胞器等在自噬體中分隔，并在溶酶體中降解為特征?？傮w來講，自噬被認為是一種非選擇性的降解機制。近來的研究表明自噬在很多生理和病理過程中扮演重要角色，比如對于神經退行性疾病突變蛋白和受損細胞器的清除等。自噬可以中文摘要以調控長壽蛋白和細胞器的降解利用，參與細胞質的重建、維持細胞質的穩(wěn)定，所以一般認為長半衰期的蛋白、有聚集傾向的蛋白由自噬途徑來降解，無特異性，誘導性強。因此，自噬降解途徑和ALS的發(fā)病可能存在密切關系。本實驗應用家族性肌萎縮側索硬化動物模型(SODlG93A
5、轉基因小鼠)，研究疾病不同時期自噬相關指標的改變，并以饑餓作為細胞自噬的誘導劑，觀察饑餓誘導的自噬增強對ALS轉基因小鼠病程不同階段突變蛋白表達的影響。旨在研究調節(jié)自噬在ALS治療中的可能作用。方法：l實驗動物及分組采用SODlG93A轉基因小鼠及其同窩非轉基因對照小鼠，實驗期間每天觀察動物、稱重及評分。將SODlG93A轉基因小鼠按癥狀分為癥狀前期(60天)、癥狀早期(100．120天)和終末期(130．150天)。60d同窩對照小鼠分別給予禁食Oh、6h、12h、24h、48h后取材。不同疾病時期饑餓
6、組分別給予禁食48h。用10％水合氯醛按照350mg／Kg腹膜內注射麻醉，分別以4％多聚甲醛灌流固定保存或新鮮取材。2免疫組織化學法4％多聚甲醛固定的脊髓腰膨大部位經振動切片機切成厚20I_un切片，0．01MPBS溶液漂洗；3％H202浸泡，封閉組織內源性過氧化物酶；O．3％tritonX．100穿孔；10％馬血清室溫封閉，分別加入抗p62和抗SODl抗體，二抗、辣根過氧化物酶標記的鏈霉卵白素孵育后，DAB染色，撈片，脫水，透明及封片。OlympusBX51顯微鏡觀察及照相。3共聚焦顯微鏡法4％多聚甲醛
7、固定的脊髓腰膨大部位用20％蔗糖／4％多聚甲醛溶液浸泡過夜至組織沉底。冷凍環(huán)境下使用包埋劑OCT包埋組織，經冷凍切片機切成厚209rn切片，經漂洗、穿孔、封閉、一抗、熒光二抗孵育并再次PBS漂洗后，抗熒光衰減封片劑封片，OlympusFVl000激光共聚焦顯微鏡觀察及照相。4透射電鏡法實驗小鼠經4％多聚甲醛灌流固定后，準確定位腰髓前角并取材，繼續(xù)固定于4％戊二醛中。0．1MPB漂洗，鋨酸固定。丙酮梯度脫水，包埋中文摘要液浸透，包埋，超薄切片機切片。醋酸鈾和檸檬酸鉛染色后經JEM．1230透射電鏡觀察、照相
8、。5蛋白免疫印跡實驗小鼠經麻醉后，新鮮取材，取小鼠脊髓腰段，提取腰髓組織總蛋白，BCA法測蛋白濃度。蛋白上樣，SDS．PAGE電泳后轉膜，室溫脫脂奶粉封閉后，分別加一抗4。C搖床過夜。次日，加入熒光二抗，洗膜，Odyssey紅外掃描成像系統掃膜并分析結果。6熒光定量PCR新鮮取小鼠脊髓腰段，液氮速凍后，．80。C保存。提取RNA并反轉錄后，StratageneMx3005P熒光定量PCR儀擴增目的基因?！?計量資料用X+s表示
