卵巢癌中egfr表達和基因突變分析

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1、卵巢癌中EGFR表達和基因突變分析俟祥位陳立俠徐州中醫(yī)院檢驗科江蘇徐州221000【摘要】目的：檢測卵巢癌組織中表皮牛長因了受體(epidermalgrowthfactorrecptor,EGFR)表達及基因突變的情況，為針對EGFR的靶向治療在卵巢癌中的應用提供理論依據(jù)。方法：在醫(yī)院取得卵巢70例卵巢癌組織標木，運用多聚酶鏈式反應(polymerasechainreaction,PCR)及多聚酶鏈式反應■限制性內切酶片段長度多態(tài)性(PCR-restrictionfragmentlengthpolymorphis

2、m,PCR-RFLP)分別檢測卵巢癌組織EGFR基因是否有第19外顯子的缺失及第21外顯子的L858R點突變。結果：在70例卵巢癌組織中，PCR未檢測到EGFR基因第19外顯子缺失突變,PCR-RFLP未檢測到第21外顯子的L858R點突變。結論：卵巢癌組織EGFR基因中未檢測到第19外顯子缺失突變和第21外顯子的L858R點突變。【關鍵詞】卵巢癌；基因突變；表皮牛長因子受體基因引言：卵巢惡性腫瘤是女性牛殖器官常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率僅次于子宮頸癌和子宮體癌而列居第三位。但是卵巢上皮癌死亡率卻占各類婦科腫瘤的第

3、一位，對婦女牛命造成非常嚴重的威脅。由于卵巢的胚胎發(fā)育、組織解剖及內分泌功能較復雜，早期癥狀不典型，術前鑒別卵巢腫瘤的組織類型及良惡性相當困難。卵巢惡性腫瘤中以上皮癌最多見，其次是惡性生殖細胞腫瘤。卵巢上皮癌患者手術中發(fā)現(xiàn)腫瘤局限于卵巢的僅占百分之三十，大多數(shù)已擴散到子宮，雙側附件，大網(wǎng)膜及盆腔各器官，所以在早期診斷上是一大難題。一、材料與方法(―)標木來源取2008年02月至2014年06月醫(yī)院手術切除并經(jīng)病理證實的70例卵巢癌組織作為研究樣木?；颊吣挲g15-71歲，中位年齡53歲。其中上皮性卵巢癌61例(包括

4、46例漿液性卵巢癌、口例黏液性卵巢癌、1例移行細胞癌、2例透明細胞癌和1例子宮內膜樣癌），生殖細胞癌5例（包括4例無性細胞癌和1例未成熟畸胎瘤），轉移性卵巢癌4例?；颊咝g前均未進行任何化療或放療。上海同濟醫(yī)院提供的2例NSCLC的DNA模板為陽性對照，其EGFR基因有第19外顯子E746-A750缺失突變（即第746-752位密碼子的堿基缺失）及第21外顯子L858R點突變。（二）引物合成根據(jù)Genebank公開發(fā)表的人EGFR基因序列（編號NG007726）,利用Iigo6.0軟件針對EGFR的第19和第21外

5、顯子設計引物，引物由上海生工生物工程公司合成。引物序列見表lo（三）酚■氯仿法抽提卵巢癌組織中DNA切除腫瘤石蠟組織周圍多余石蠟后，將3-4片約5mm厚的組織切片放入1.5ml的離心管中，加入二甲苯脫蠟，微微搖動，換液3次。用無水乙醇水化脫二甲苯，換液3次，晾干。于離心管中加入消化液，37°C消化過夜，然后用酚■氯仿法抽提消化后腫瘤組織中的DNAo于抽提出的DNA中加入抗?DNA磁珠和裂解液，震蕩混勻，并靜置lOmin,置管于磁性臺架使磁珠聚集，然后去除上清液。再于管內加入洗滌液洗滌，置管于磁性臺架洗去非特異性結

6、合物質，重復此操作1次。最后加入洗脫液洗脫吸附在磁珠上的DNA,將含有DNA的上清液冋收至新的1.5ml離心管中，放置?80°C凍存?zhèn)溆?。（四）PCR擴增EGFR基因第19外顯子和第21外顯子PCR反應體系：在20μIPCR反應體系中，加入DNA模板2μl,10×PCR緩沖液2μhMgCI21.4μl（25mmol/L）,4種dNTP0.4μl（lOmmol/L）,上下游引物混合物0.2μl（25mmol/L）,TaqDNA聚合酶1U,用雙蒸水補足反應體積至20&m

7、u;loPCR循環(huán)參數(shù)：預變性95°C、4min,95°C、30s,56°C、30s,72°C、lmin,共35個循環(huán)，最后72°C延伸10minoEGFR基因第19外顯子與陽性對照（NSCLC組織DNA）PCR擴增產物行2%瓊脂糖電泳。EGFR基因第19外顯子突變?yōu)槿笔蛔?，缺失片段長12?20bpoEGFR基因第21外顯子擴增產物進行后續(xù)檢測。二、結果（一）EGFR基因第19外顯子未發(fā)現(xiàn)缺失突變70例卵巢癌組織EGFR基因第19外顯子的PCR擴增產物經(jīng)電泳檢測均顯示為243bp的單一條帶，未見低于243bp的

8、條帶（圖1）。而陽性對照的NSCLC組織EGFR基因第19外顯子的PCR擴增產物的電泳顯示為2條帶，一條和卵巢癌的條帶一致，為243bp,一條長度為228bp<,因此，卵巢癌組織的EGFR基因第19外顯子未發(fā)現(xiàn)缺失突變。（-）EGFR基因第第21外顯子未發(fā)現(xiàn)點突變將卵巢癌組織EGFR基因第21外顯子擴增產物經(jīng)MscI酶切后，2%瓊脂糖電泳檢測，L858R點突變的陽性對照N